蟾毒靈通過誘導細胞凋亡和化療增敏在非小細胞肺癌細胞中發(fā)揮抗腫瘤作用.pdf

1、肺癌是世界范圍內發(fā)病率最高的惡性腫瘤，其中非小細胞肺癌(non-smallcell lung cancer，NSCLC)占全部肺癌的80％以上，居腫瘤死亡原因之首。NSCLC生物學特征為易發(fā)生局部浸潤和遠處轉移，多數患者在診斷時已處于局部晚期或有遠處轉移，整體五年生存率僅15％。對于此部分患者，第三代新藥聯合鉑類為的化療是一線治療，對順鉑敏感性下降是療效降低的主要原因，往往導致治療失敗。因此，迫切需要探索新的治療方案。
　　既往的

2、臨床試驗研究證實許多自中草藥具有有效抗腫瘤作用，許多中藥也已經用于腫瘤的輔助治療。蟾毒靈作為中草藥蟾酥的提取物之一，相對分子質量為386.5，屬強心甙類物質。研究發(fā)現，其可以通過調控不同的分子通路對多種實體腫瘤如胰腺癌、胃癌、乳腺癌產生抗瘤作用，也有研究證實蟾毒靈可抑制肺癌細胞的增殖，但其機制尚不明確。此外，另有研究表明蟾毒靈具有化療增敏作用，甚至可以逆轉腫瘤細胞的耐藥性。然而，蟾毒靈對NSCLC細胞的抗腫瘤機制以及化療增敏作用尚不明確

3、。
　　本實驗旨在研究蟾毒靈對NSCLC細胞的作用及潛在分子機制，探索蟾毒靈對NSCLC順鉑化療敏感性的影響及可能參與機制，我們選用A549和H1975這兩株NSCLC細胞為模型，分三個部分進行研究。
　　第一部分 蟾毒靈對非小細胞肺癌A549和H1975細胞增殖的影響
　　目的:研究蟾毒靈是否抑制NSCLC細胞增殖能力及遷移能力。
　　方法:利用不同濃度的蟾毒靈分別處理A549和H1975細胞24h、48h和7

4、2h，采用CCK-8法檢測細胞增殖活性的改變，采用劃痕實驗觀察細胞遷移能力改變。
　　結果:A549和H1975細胞經不同濃度（2.5nM，5nM，10nM，20nM，40nM，80nM，100nM，200nM）的蟾毒靈處理后，兩株細胞均呈現為:經低濃度蟾毒靈(2.5nM，5nM)處理后細胞存活率在98％左右，表明細胞增殖能力無明顯抑制;細胞經較高濃度(10～200nM)蟾毒靈處理后，細胞增殖受到明顯抑制且這種抑制作用隨著蟾毒靈濃

5、度的增加，細胞的增殖抑制率增加，蟾毒靈的作用于細胞的時間的越長，細胞的增殖抑制越明顯。劃痕實驗結果表明，細胞經蟾毒靈處理后，細胞遷移能力下降，劃痕愈合能力降低，且藥物濃度越高，對細胞遷移能力抑制越明顯。
　　結論:蟾毒靈可以誘導A549和H1975細胞產生與濃度和作用時間相關的增殖抑制與遷移能力下降。
　　第二部分 蟾毒靈對非小細胞肺癌細胞凋亡的影響及可能的分子機制
　　目的:研究蟾毒靈對A549和H1975細胞凋亡的

6、影響及可能參與機制。
　　方法:以不同濃度的蟾毒靈（0nM，10nM，20nM）作用于A549和H1975細胞48h，采用流式細胞術檢測藥物對細胞凋亡比率影響;采用Western blotting技術檢測A549和H1975細胞中凋亡蛋白parp及Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白β-catenin及其下游分子c-myc和cyclinD1的表達，以及干細胞標記Oct-4表達水平。
　　結果:對細胞凋亡比率的檢測結果表

7、明，兩株細胞均表現為:隨著蟾毒靈濃度的增加，細胞的凋亡比率呈現增加趨勢，這個現象說明蟾毒靈可以誘導細胞凋亡，且藥物濃度越高，凋亡比率越高。Western blotting顯示，藥物處理后，PARP被降解，而cleaved-PARP表達水平升高;Wnt/β-catenin信號通路β-catenin及其下游分子c-myc和cyclinD1表達均下調，腫瘤干細胞標記Oct-4表達也降低。且藥物濃度越高，蛋白表達降低越明顯。
　　結論:蟾

8、毒靈在A549和H1975細胞中可能是可能是通過抑制Wnt/β-catenin信號通路的活化，降低β-catenin及下游分子的表達以及抑制腫瘤干細胞亞群比例，進而誘導細胞凋亡增加。
　　第三部分 蟾毒靈對非小細胞肺癌細胞的順鉑化療增敏作用及可能分子機制
　　目的:研究蟾蜍靈是否可增加A549和H1975細胞的順鉑敏感性及其潛在分子機制。
　　方法:本文第一部分結果可知，NSCLC細胞經低濃度蟾毒靈(2.5nM，5nM

9、)處理后存活率在98％左右，低濃度蟾毒靈對細胞增殖能力無明顯影響。采用CCK-8法檢測低濃度蟾毒靈、順鉑單藥及聯合分別作用于A549和H1975細胞48h后細胞增殖活性變化;采用流式細胞儀檢測蟾毒靈、順鉑單藥及聯合處理A549細胞（蟾毒靈5nM、順鉑5μg/mL）與H1975細胞(蟾毒靈5nM、順鉑1μg/mL)48 h后細胞凋亡比率;采用Western blotting檢測蟾毒靈、順鉑單藥及聯合處理后A549和H1975細胞中NF-κ

10、B及其下游分子c-myc表達水平的改變。
　　結果:兩株細胞經上述處理后均表現為:與單獨應用順鉑相比，低濃度蟾毒靈與順鉑聯合應用可明顯增加順鉑對A549與H1975細胞的增殖抑制作用。流式檢測結果顯示，低濃度蟾毒靈組無明顯細胞凋亡誘導作用，而聯合組細胞凋亡比率明顯大于順鉑組，說明低濃度蟾毒靈可以增加A549與H1975細胞對順鉑的藥物敏感性。低濃度蟾蜍靈與順鉑聯合組細胞NF-κB及其下游分子c-myc蛋白表達水平較順鉑單藥組明顯降