蟾毒靈通過內質網應激途徑誘導膠質瘤細胞凋亡與自噬的分子機制研究.pdf

1、膠質瘤是一種常見的中樞神經系統(tǒng)腫瘤，盡管目前應對腫瘤有多種治療措施，但惡性膠質瘤患者的預后仍較差，因此尋找新型抗腫瘤藥物依然具有重要意義。蟾毒靈是中藥蟾酥的主要成分，是從中華大蟾蜍分泌的毒液中提取的，目前，對蟾毒靈抗腫瘤機制的研究多集中在各種類型的肝癌細胞，其對膠質瘤細胞的作用尚未見報道。本實驗的目的是研究蟾毒靈對膠質瘤的生長是否具有抑制作用，并探討其相應的分子機制。
　　用不同濃度蟾毒靈作用U87MG細胞24或48小時，選取各種

2、方法處理，觀察處理后的細胞形態(tài)學和分子生物學特性的變化。細胞增殖抑制實驗(MTT)觀察不同處理對細胞增殖的影響;流式細胞術檢測ROS水平的變化及細胞凋亡情況;吖啶橙和MDC染色觀察自噬泡的存在，從而檢測細胞自噬水平的變化;脂質體轉染si-RNA以降低某一基因的表達;蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測不同處理后凋亡、自噬及內質網應激相關蛋白表達水平的變化。
　　MTT結果表明，用不同濃度蟾毒靈處理U87MG細胞24和48

3、小時，蟾毒靈可有效抑制膠質瘤細胞的增殖。Bax/Bcl-2比值升高，細胞色素c及CleavedCaspase-3和Cleaved PARP的上調表明，蟾毒靈可誘導U87MG細胞發(fā)生線粒體途徑凋亡。
　　蟾毒靈可激活自噬的證據包括酸性自噬泡的形成、自噬溶酶體的增加及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的上調。進一步的實驗表明，蟾毒靈誘導自噬的機制與其降低細胞內ATP含量、激活AMPK，抑制mTOR及其下游蛋白4EBP1和p70S6K有關。

4、　　用自噬抑制劑3-MA抑制自噬可增強蟾毒靈誘導的細胞凋亡并促進凋亡蛋白Cleaved Caspse-3及Cleaved PARP的表達。干擾自噬基因Beclin1或Atg5后，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ灰度比降低，而凋亡蛋白cleaved PARP活性增強。這些結果說明自噬在蟾毒靈誘導的細胞凋亡中發(fā)揮保護性作用。
　　蟾毒靈誘導U87MG細胞發(fā)生內質網應激的證據包括非折疊蛋白反應(UPR)感受蛋白PERK、IRE1α、eIF2α的磷酸化

5、水平升高和內質網應激標志蛋白GRP78和GRP94的表達量的上調。CHOP和內質網應激凋亡特有的Caspase4的激活，表明蟾毒靈還可誘導U87MG細胞發(fā)生內質網應激所介導的凋亡。此外，用si-CHOP抑制CHOP的表達可使蟾毒靈誘導的細胞凋亡率下降，這進一步說明了內質網應激在蟾毒靈誘導凋亡中的重要作用。周內質網應激抑制劑TUDC或干擾內質網應激蛋白eIF2α、CHOP的表達，可部分抑制蟾毒靈誘導的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的上調，說明內質