貝伐單抗通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機(jī)制誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞凋亡.pdf

1、目的：觀察貝伐單抗對(duì)肺癌A549細(xì)胞的影響，探索其作用機(jī)制。
　　方法：1.貝伐單抗處理A549細(xì)胞，A549細(xì)胞用含量為10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)，培養(yǎng)在溫度37℃，CO2濃度5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。貝伐單抗用滅菌注射用水稀釋。細(xì)胞用濃度為0μM、1μM、5μM、25μM的貝伐單抗處理12、24、48或72小時(shí)。
　　2.CCK-8法檢測(cè)A549細(xì)胞增殖抑制，A549細(xì)胞接種到96孔板中（100μL/孔），用不同濃

2、度（0μM、1μM、5μM、25μM）的貝伐單抗處理12、24、48、72小時(shí)后，每孔加入10μL的CCK-8溶液。在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4小時(shí)，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的吸光值。每次處理重復(fù)三次，計(jì)算平均值。
　　3.流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)A549細(xì)胞凋亡，A549細(xì)胞接種在60-mm平板過夜，用不同濃度（0μM、1μM、5μM、25μM）貝伐單抗處理24小時(shí)，PBS緩沖液洗滌三次，0.25%tryptan-EDTA消化。離心后，將細(xì)胞

3、在0.5ml PBS中的懸浮。細(xì)胞用膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）和碘化丙啶（PI）染色，RNA酶和0.1％Triton X-100室溫處理30分鐘。用熒光激活細(xì)胞分選儀進(jìn)行流式細(xì)胞分析。
　　4.熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)RNA表達(dá)，總mRNA的提取來自經(jīng)不同濃度（0μM、1μM、5μM、25μM）貝伐單抗處理的細(xì)胞，使用Ambion RNA-queous試劑盒。高容量cDNAArchive試劑盒用來獲得的mRNA的第一鏈cDNA

4、。CHOP、caspase-4、IRE1、XBP-1的mRNA水平檢測(cè)通過特異性基因表達(dá)測(cè)定試劑盒、實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-time PCR）檢測(cè)系統(tǒng)完成。
　　5.蛋白免疫印跡技術(shù)檢測(cè)蛋白表達(dá)，將細(xì)胞溶解，收集上清液，用已知的方法萃取胞漿蛋白或核蛋白。在電壓為120mV的三鹽酸聚丙烯酰胺凝膠，將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯印跡膜，膜上用特異性多克隆抗體做探針。從蛋白裂解液中取得相同的蛋白量進(jìn)行電泳分析，β-actin做為內(nèi)參。

5、 結(jié)果：1.貝伐單抗處理肺癌A549細(xì)胞12小時(shí)，表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用輕微，但處理24小時(shí)后則顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并呈劑量依賴性。與此相反，作為對(duì)照組的貝伐單抗（0μM）在對(duì)任一時(shí)間處理過的細(xì)胞系中沒有顯著抑制作用。這些數(shù)據(jù)表明，貝伐單抗可抑制A549細(xì)胞增殖。
　　2.我們采用流式細(xì)胞儀評(píng)估貝伐單抗對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果表明，在使用貝伐單抗處理24小時(shí)后，可顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這表明貝伐單抗參與了導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的信號(hào)通

6、路。
　　3.我們進(jìn)一步研究了貝伐單抗通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）介導(dǎo)的途徑誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的可能性。細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致的未折疊蛋白反應(yīng)（（unfolded protein response，UPR）中，我們選取內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激上游肌醇需求酶1（inositol requiring enzyme1，IRE-1）、X盒結(jié)合蛋白1（X-box binding protein1，XBP

7、1）作為檢測(cè)指標(biāo)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)性凋亡（endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis,ERSIA）信號(hào)通路中選取C/EBP同源蛋白（C/EBP-homologous protein，CHOP）、半胱天冬氨酸4（caspase-4）作為檢測(cè)指標(biāo)。結(jié)果表明，在RNA水平較對(duì)照組（0μM）而言，XBP-1在濃度為1μM、5μM、25μM各組的表達(dá)均明顯增加，為2.196±0.101，4.605±

8、0.413，2.532±0.185（p<0.01）；CHOP（25μM）組及caspase-4（5μM）組的表達(dá)也有小幅增加，為2.191±0.112，1.588±0.167（p<0.05）。在蛋白水平，CHOP的表達(dá)水平較對(duì)照組（0μM）0.33±0.08而言，濃度為1μM、5μM、25μM各組的表達(dá)均明顯增加，為0.67±0.08，1.52±0.24，1.32±0.31（p<0.05）；caspase-4的表達(dá)較對(duì)照組（0μM）0.

9、24±0.08而言，濃度為5μM、25μM兩組的表達(dá)均有增加，為0.65±0.15，0.63±0.23（p<0.05）。我們的數(shù)據(jù)顯示貝伐單抗激活了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)性凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)。
　　結(jié)論：1.貝伐單抗在體外可抑制肺癌A549細(xì)胞增殖。
　　2.貝伐單抗在體外可促進(jìn)肺癌A549細(xì)胞凋亡。
　　3.貝伐單抗在抑制肺癌A549細(xì)胞增殖以及在促進(jìn)肺癌A549細(xì)胞凋亡過程中，出現(xiàn)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)通路的活化。
　　4.貝伐