EGCG通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡途徑減輕高糖致足細胞損傷.pdf

1、研究背景及目的:
　　糖尿病(diabetes，DM)發(fā)病率隨著當代生活方式的改變逐年增加，糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是DM最嚴重的慢性微血管并發(fā)癥之一，其患病率也隨之升高。在終末期腎衰竭(end-stage renal disease，ESRD)患者中由DN所占的比例也逐年增加。足細胞是不可再生的高度分化細胞，研究證明足細胞的損傷和凋亡在DN的發(fā)病和進展機制中占有重要地位。細胞在高糖環(huán)境下發(fā)生形

2、態(tài)和結(jié)構(gòu)改變?nèi)绶蚀?、足突分離、足細胞表面蛋白丟失、嚴重可致足細胞發(fā)生凋亡。其中凋亡與DN的發(fā)病機制密切相關(guān)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是多功能細胞器，除參與機體物質(zhì)合成代謝外，在維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中也起著重要的調(diào)節(jié)作用。高糖、氧化應(yīng)激等作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)時，持續(xù)的有害因素會啟動內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡程序使細胞發(fā)生凋亡。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechi-3-gallate，EGCG)是綠茶中含有茶多酚，研究表明EGCG在腫瘤、腦血管病、冠心病等慢性疾病

3、發(fā)揮重要的預(yù)防作用。但EGCG是否對糖尿病腎病具有預(yù)防作用及是否具有保護足細胞的作用至今未見明確報道。在該實驗中通過高糖誘導(dǎo)足細胞，建立細胞凋亡模型，比較EGCG干預(yù)前后足細胞的增殖能力、足細胞表面蛋白Nephrin和WT-1的表達、足細胞的凋亡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白分子葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulatingprotein，GRP78)、磷酸化蛋白激酶樣ER激酶(p-double-stranded RNA likeendopla

4、smic reticulum kinase p-PERK)半胱氨酸天冬氨酸酶12(cysteinyaspartate-specific proteinases，Caspase-12)的表達情況。目的在于探究EGCG能否減輕高糖致足細胞的凋亡及是否通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡途徑發(fā)揮對足細胞的保護作用。
　　研究方法:
　　細胞分組:①正常糖組（NG:5.6mmol/L葡萄糖）②甘露醇組(M:5.6mmol/L葡萄糖+24.4 m

5、mol/L甘露醇)③高糖組（HG:30mmol/L葡萄糖）④不同濃度的EGCG組（E1:1μmol/L+HG; E10:10μmol/L+HG; E20:20μmol/L+HG; E40:40μmol/L+HG; E60:60μmol/L+HG; E80:80μmol/L+HG;E100:100μmol/L+HG)分別培養(yǎng)24h，48h，72h用CCK8檢測細胞增殖情況，根據(jù)細胞增殖結(jié)果將其分為四組進行后續(xù)實驗①正常糖組(NG:5.6m

6、mol/L葡萄糖)②甘露醇組（M:5.6mmol/L+24.4 mmol/L甘露醇）⑧高糖組（HG:30mmol/L葡萄糖）④E20組(20μmol/L+HG)培養(yǎng)72h后Western-blotting檢測足細胞表面蛋白Nephrin和WT-1的表達，流式細胞技術(shù)以及Hoechst染色檢測細胞凋亡，Western-blotting檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡途徑中標志性蛋白分子GRP78、p-PERK、Caspase-12的表達。

7、　　結(jié)果:
　　1.足細胞的增殖:高糖刺激足細胞24h，48h，72h后，足細胞的增殖能力隨著時間增加而降低，并且細胞在培養(yǎng)72h后更為明顯。EGCG組在高糖環(huán)境下能夠促進足細胞的增殖，并且EGCG的濃度為20μmol/L培養(yǎng)72h后對促進足細胞的增殖更明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　2.足細胞的損傷:各組細胞培養(yǎng)72h后，足細胞表面蛋白分子Nephrin和WT-1在HG組的表達明顯的低于NG組和M組(P＜0.

8、05);與HG組相比，E20組足細胞Nephrin和WT-1表達增加(P＜0.05)。
　　3.足細胞的凋亡:流式細胞術(shù)顯示:HG組足細胞的凋亡率(22.48％)明顯高于NG組(0.55％)和M組(0.72％)(P＜0.05)，而E20組細胞的凋亡率(6.57％)明顯低于HG組(P＜0.05); Hoechst染色顯示:NG組和M組足細胞核形態(tài)大小一致、核質(zhì)均勻，HG組足細胞的細胞核則呈現(xiàn)固縮變小或花瓣狀等典型的凋亡形態(tài)改變，E2