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文檔簡介
1、研究背景與目的:非酒精性脂肪肝(NAFLD)是由非酒精性因素引起的肝細胞脂質(zhì)過量蓄積而導致的一種慢性代謝紊亂性疾病。由于NAFLD在國內(nèi)外的發(fā)病率逐年上升,闡明其發(fā)生發(fā)展的分子機制,為臨床治療提供實驗基礎顯得十分必要。近年,不斷有研究提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(ERS)與NAFLD的發(fā)生存在相關性。固醇調(diào)節(jié)原件結(jié)合蛋白(SREBP)-1c、肝X受體(LXRs)通過調(diào)節(jié)下游靶基因脂肪酸合成酶(FAS)參與肝細胞內(nèi)脂肪酸從頭合成。并且,SREBP-1c
2、的表達調(diào)控分為轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平,即前體蛋白和活性蛋白兩部分。本研究擬應用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激激動劑毒胡蘿卜素(Tg)建立肝細胞ERS模型,了解ERS狀態(tài)下對肝細胞脂質(zhì)代謝的影響,通過實時熒光定量PCR(Q-PCR)和免疫蛋白印跡法(Western-blot)觀察FAS、SREBP-1c(前體蛋白和活性蛋白)、LXRα的表達變化,探討毒胡蘿卜素誘導ERS引起肝細胞脂肪沉積的可能機制。
方法:
1、細胞培養(yǎng):將人肝L02細
3、胞和HepG2細胞分別用含10%胎牛血清、0.0625g/L青霉素、0.1g/L鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液和高糖DMEM培養(yǎng)液,37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。
2、實驗分組:正常對照組(培養(yǎng)液中不加藥物)和實驗組(培養(yǎng)液中加入最佳實驗濃度的毒胡蘿卜、素)。
3、CCK-8比色法測定細胞增殖,Western Blot法檢測毒胡蘿卜素刺激后肝細胞葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(GRP)78的表達情況,TG試劑
4、盒和油紅O染色了解肝細胞脂質(zhì)沉積情況。
4、實時熒光定量PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測肝細胞內(nèi)LXRα、SREBP-1c、FAS mRNA及蛋白表達的變化。
結(jié)果:
第一部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激對肝細胞脂質(zhì)代謝的影響
1、毒胡蘿卜素最佳作用濃度及時間點的篩選:通過CCK8方法檢測24h、48h、72h下0.5、1、2、4μmol/L濃度毒胡蘿卜素作用L02細胞增殖抑制率,結(jié)果顯示72h時0.5μm
5、ol/L毒胡蘿卜素對細胞生長抑制率達到20%,結(jié)合參考文獻,選用1μtmol/L為最佳藥物濃度,24h、48h作藥物作用時間。
2、各組GRP78表達檢測:1μtmol/L毒胡蘿卜素誘導L02、HepG2細胞24h、48h后GRP78蛋白表達較對照組明顯升高,各組間差異有統(tǒng)計學意義(L02細胞、HepG2細胞分別為F=29.39、34.56,p=0.0008、0.0005),說明1μmo l/L毒胡蘿卜、素成功誘導建立肝細
6、胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激模型。
3、各組脂質(zhì)的檢測
(1) TG檢測:L02細胞中,經(jīng)毒胡蘿卜素處理后,與對照組相比,24h實驗組TG檢測差異無統(tǒng)計學意義,而48h實驗組(145.50±2.48μg/mg)較對照組(96.54±4.03μg/mg)脂肪沉積增加,后續(xù)研究選取48h作為誘導時間。用毒胡蘿卜素對HepG2細胞處理48h后,與對照組(121.52±4.73μg/mg)相比,實驗組(276.98±6.68μg/m
7、g) HepG2細胞脂肪沉積顯著增加。
(2)油紅O染色:與對照組相比較,經(jīng)毒胡蘿卜素處理48h后L02和HepG2細胞形態(tài)改變、脂肪沉積明顯。
第二部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激對肝細胞脂質(zhì)代謝影響的機制
1、肝細胞內(nèi)LXRα、SREBP-1c mRNA的表達情況:與對照組比較,1μmol/L毒胡蘿卜素作用肝細胞48h后,實驗組SREBP-1c mRNA表達增加,差異有統(tǒng)計學意義;而LXRα mRNA的表達量
8、,實驗組與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義。
2、肝細胞內(nèi)LXRα、SREBP-1c和FAS蛋白的表達情況:分別檢測SREBP-1c前體蛋白和活性蛋白,結(jié)果顯示SREBP-1c在蛋白水平,前體蛋白實驗組較對照組增加,并且活性蛋白與前體蛋白呈現(xiàn)一致的趨勢。同時,F(xiàn)AS的蛋白表達情況與SREBP-1c相同,實驗組肝細胞較對照組增加。然而,LXRα蛋白表達實驗組與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義。
結(jié)論:
1、毒
9、胡蘿卜素可誘導肝細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激并引起脂質(zhì)沉積。
2、在肝細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激導致脂代謝紊亂的過程中,SREBP-1c轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后及FAS表達水平均明顯升高,顯示SREBP-1c-FAS可能是介導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導肝細胞脂質(zhì)沉積的重要機制。
3、在肝細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激導致脂代謝紊亂的過程中,LXRαmRNA及蛋白水平均無明顯變化,提示LXRs-SREBP-1c和LXRs-FAS途徑可能沒有參與毒胡蘿卜、素誘導內(nèi)質(zhì)
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