內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激通過SREBP-1c-FAS途徑影響肝細胞脂質(zhì)沉積.pdf_第1頁
已閱讀1頁,還剩52頁未讀, 繼續(xù)免費閱讀

下載本文檔

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進行舉報或認領

文檔簡介

1、研究背景與目的:非酒精性脂肪肝(NAFLD)是由非酒精性因素引起的肝細胞脂質(zhì)過量蓄積而導致的一種慢性代謝紊亂性疾病。由于NAFLD在國內(nèi)外的發(fā)病率逐年上升,闡明其發(fā)生發(fā)展的分子機制,為臨床治療提供實驗基礎顯得十分必要。近年,不斷有研究提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(ERS)與NAFLD的發(fā)生存在相關性。固醇調(diào)節(jié)原件結(jié)合蛋白(SREBP)-1c、肝X受體(LXRs)通過調(diào)節(jié)下游靶基因脂肪酸合成酶(FAS)參與肝細胞內(nèi)脂肪酸從頭合成。并且,SREBP-1c

2、的表達調(diào)控分為轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平,即前體蛋白和活性蛋白兩部分。本研究擬應用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激激動劑毒胡蘿卜素(Tg)建立肝細胞ERS模型,了解ERS狀態(tài)下對肝細胞脂質(zhì)代謝的影響,通過實時熒光定量PCR(Q-PCR)和免疫蛋白印跡法(Western-blot)觀察FAS、SREBP-1c(前體蛋白和活性蛋白)、LXRα的表達變化,探討毒胡蘿卜素誘導ERS引起肝細胞脂肪沉積的可能機制。
   方法:
   1、細胞培養(yǎng):將人肝L02細

3、胞和HepG2細胞分別用含10%胎牛血清、0.0625g/L青霉素、0.1g/L鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液和高糖DMEM培養(yǎng)液,37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。
   2、實驗分組:正常對照組(培養(yǎng)液中不加藥物)和實驗組(培養(yǎng)液中加入最佳實驗濃度的毒胡蘿卜、素)。
   3、CCK-8比色法測定細胞增殖,Western Blot法檢測毒胡蘿卜素刺激后肝細胞葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(GRP)78的表達情況,TG試劑

4、盒和油紅O染色了解肝細胞脂質(zhì)沉積情況。
   4、實時熒光定量PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測肝細胞內(nèi)LXRα、SREBP-1c、FAS mRNA及蛋白表達的變化。
   結(jié)果:
   第一部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激對肝細胞脂質(zhì)代謝的影響
   1、毒胡蘿卜素最佳作用濃度及時間點的篩選:通過CCK8方法檢測24h、48h、72h下0.5、1、2、4μmol/L濃度毒胡蘿卜素作用L02細胞增殖抑制率,結(jié)果顯示72h時0.5μm

5、ol/L毒胡蘿卜素對細胞生長抑制率達到20%,結(jié)合參考文獻,選用1μtmol/L為最佳藥物濃度,24h、48h作藥物作用時間。
   2、各組GRP78表達檢測:1μtmol/L毒胡蘿卜素誘導L02、HepG2細胞24h、48h后GRP78蛋白表達較對照組明顯升高,各組間差異有統(tǒng)計學意義(L02細胞、HepG2細胞分別為F=29.39、34.56,p=0.0008、0.0005),說明1μmo l/L毒胡蘿卜、素成功誘導建立肝細

6、胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激模型。
   3、各組脂質(zhì)的檢測
   (1) TG檢測:L02細胞中,經(jīng)毒胡蘿卜素處理后,與對照組相比,24h實驗組TG檢測差異無統(tǒng)計學意義,而48h實驗組(145.50±2.48μg/mg)較對照組(96.54±4.03μg/mg)脂肪沉積增加,后續(xù)研究選取48h作為誘導時間。用毒胡蘿卜素對HepG2細胞處理48h后,與對照組(121.52±4.73μg/mg)相比,實驗組(276.98±6.68μg/m

7、g) HepG2細胞脂肪沉積顯著增加。
   (2)油紅O染色:與對照組相比較,經(jīng)毒胡蘿卜素處理48h后L02和HepG2細胞形態(tài)改變、脂肪沉積明顯。
   第二部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激對肝細胞脂質(zhì)代謝影響的機制
   1、肝細胞內(nèi)LXRα、SREBP-1c mRNA的表達情況:與對照組比較,1μmol/L毒胡蘿卜素作用肝細胞48h后,實驗組SREBP-1c mRNA表達增加,差異有統(tǒng)計學意義;而LXRα mRNA的表達量

8、,實驗組與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義。
   2、肝細胞內(nèi)LXRα、SREBP-1c和FAS蛋白的表達情況:分別檢測SREBP-1c前體蛋白和活性蛋白,結(jié)果顯示SREBP-1c在蛋白水平,前體蛋白實驗組較對照組增加,并且活性蛋白與前體蛋白呈現(xiàn)一致的趨勢。同時,F(xiàn)AS的蛋白表達情況與SREBP-1c相同,實驗組肝細胞較對照組增加。然而,LXRα蛋白表達實驗組與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義。
   結(jié)論:
   1、毒

9、胡蘿卜素可誘導肝細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激并引起脂質(zhì)沉積。
   2、在肝細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激導致脂代謝紊亂的過程中,SREBP-1c轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后及FAS表達水平均明顯升高,顯示SREBP-1c-FAS可能是介導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導肝細胞脂質(zhì)沉積的重要機制。
   3、在肝細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激導致脂代謝紊亂的過程中,LXRαmRNA及蛋白水平均無明顯變化,提示LXRs-SREBP-1c和LXRs-FAS途徑可能沒有參與毒胡蘿卜、素誘導內(nèi)質(zhì)

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負責。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評論

0/150

提交評論