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1、目的:通過(guò)本研究探討TNF-α對(duì)肝細(xì)胞脂肪變性模型固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白裂解激活蛋白(SCAP)及固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(SREBP-1c)表達(dá)的影響,探討TNF-α在非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)SCAP-SREBP-1c脂質(zhì)合成通路中的作用及可能機(jī)制。 方法: 1、建立油酸誘導(dǎo)的人肝細(xì)胞脂肪變性模型。 2、正常成人L-02肝細(xì)胞株,用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基傳代培養(yǎng),分為對(duì)照組和模型組,正常培養(yǎng)基
2、培養(yǎng)的細(xì)胞為對(duì)照組(簡(jiǎn)稱C組),正常培養(yǎng)基加油酸誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞為模型組(簡(jiǎn)稱F組),另外兩組加入TNF-α(C組+TNF-α,簡(jiǎn)稱C1組;F組+TNF-α,簡(jiǎn)稱F1組)。TNF-α終濃度為200ng/mL。 3、油紅0染色光學(xué)顯微鏡觀察肝細(xì)胞脂滴積聚的情況。 4、RT-PCR法檢測(cè)各組SCAP、SREBP-1c、FASmRNA表達(dá)變化。 5、Westernblot法檢測(cè)各組SCAP、SREBP-1c蛋白表達(dá)變化。
3、 6、采用酶底物結(jié)合反應(yīng)檢測(cè)肝細(xì)胞FAS活性變化。 7、檢測(cè)各組肝細(xì)胞內(nèi)甘油三酯(TG)的含量。 結(jié)果: 1、成功地建立了油酸誘導(dǎo)的L-02肝細(xì)胞株脂肪變性模型。油紅0染色光學(xué)顯微鏡觀察對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)未見(jiàn)紅色脂滴。模型組在培養(yǎng)24小時(shí)后細(xì)胞內(nèi)即可見(jiàn)少量脂肪變細(xì)胞,72小時(shí)可見(jiàn)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)聚集了較多橘紅色的脂滴。電鏡觀察對(duì)照組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)偶見(jiàn)脂滴出現(xiàn)。模型組肝細(xì)胞體積較大,較多脂滴存在于胞質(zhì)中;核膜迂曲輪廓不清;細(xì)胞
4、內(nèi)線粒體數(shù)量減少,基質(zhì)腫脹,嵴稀疏。 2、油紅0染色光學(xué)顯微鏡觀察C組未見(jiàn)肝細(xì)胞脂肪變,細(xì)胞排列緊密,邊緣清晰,細(xì)胞核清晰可見(jiàn)。C1組可見(jiàn)少量脂肪變細(xì)胞,F(xiàn)組可見(jiàn)大量脂肪變細(xì)胞,F(xiàn)1組脂變細(xì)胞最多,細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)量明顯增多,部分融合成較大的脂滴,將細(xì)胞核推擠于一側(cè)。 3、各組肝細(xì)胞SCAP、SREBP-1c、FASmRNA表達(dá)的比較:C1、F、F1組較對(duì)照組增高(P<0.01),F(xiàn)1組增加最顯著。C1組與C組比較、F1組與
5、F組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 4、SCAP、SREBP-1c蛋白的表達(dá)與mRNA表達(dá)變化規(guī)律一致。 5、FAS活性的比較:C1、F、F1組較C組增高(P<0.01),其中F1組最高。C1組與C組比較、F1組與F組比較差異有顯著意義(P<0.01),但F1組增加更明顯。 6、肝細(xì)胞內(nèi)TG含量的比較:C1、F、F1組較C組增高(P<0.01),其中F1組最高。C1組與C組比較、F1組與F組比較差異有顯
6、著意義(P<0.01),但F1組增加更明顯,表明TNF-α對(duì)C組、F組均有作用,但對(duì)F組作用更明顯。 結(jié)論: 1、采用L-02肝細(xì)胞株可以成功制作培養(yǎng)的肝細(xì)胞脂肪變性模型。 2、TNF-α可上調(diào)正常L-02肝細(xì)胞及脂肪變性肝細(xì)胞SCAP、SREBP-1c、FAS的表達(dá),促進(jìn)肝細(xì)胞內(nèi)TG的合成與蓄積。 3、TNF-α作用于正常肝細(xì)胞時(shí),少數(shù)肝細(xì)胞也可發(fā)生脂肪變性,當(dāng)作用于模型組時(shí),發(fā)生脂肪變性的肝細(xì)胞數(shù)量較
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