飽和脂肪酸誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)肝細(xì)胞脂毒性凋亡的作用和機(jī)制探討.pdf

1、背景與目的:
　　非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種由遺傳-環(huán)境-代謝應(yīng)激相關(guān)因素所致的以肝細(xì)胞內(nèi)脂肪堆積為主要表現(xiàn)的臨床病理綜合征。在我國，NAFLD的發(fā)病率日趨升高，并已成為嚴(yán)重威脅人民健康的主要疾病之一。NAFLD包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)、脂肪性肝纖維化和肝硬化。單純性脂肪肝

2、進(jìn)展緩慢，NASH時(shí)肝內(nèi)巨噬細(xì)胞、星狀細(xì)胞活化，導(dǎo)致肝內(nèi)炎癥、纖維化的發(fā)生發(fā)展，最終可進(jìn)展為肝硬化、原發(fā)性肝癌等終末期肝病。最近研究發(fā)現(xiàn)，NASH患者并發(fā)心腦血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)也明顯上升，如動(dòng)脈粥樣硬化、腦梗死、心肌梗死等。因此，是否存在NASH是影響NAFLD患者預(yù)后的重要因素。至今，NASH的發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明。血中游離脂肪酸(free fatty acids，F(xiàn)FAs)濃度升高、肝細(xì)胞脂性病變及凋亡增加是NASH的重要特征。當(dāng)循環(huán)中

3、FFAs水平升高超過肝臟的氧化和代謝能力時(shí)，脂質(zhì)在肝臟異位沉積、炎性因子釋放和凋亡信號(hào)啟動(dòng)，同時(shí)肝細(xì)胞對(duì)炎性反應(yīng)和各種損傷因素的敏感性增高，由此導(dǎo)致的肝細(xì)胞功能障礙或死亡稱為脂毒性;由此引起的肝細(xì)胞凋亡，稱為脂毒性凋亡。肝細(xì)胞脂毒性凋亡在NASH的發(fā)生進(jìn)展中是重要的始動(dòng)環(huán)節(jié)并且參與整個(gè)發(fā)病過程。
　　目前NASH與肝細(xì)胞脂毒性凋亡的機(jī)制尚不完全明了。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)功能復(fù)雜，主要與蛋白的加

4、工成熟、鈣離子儲(chǔ)存、脂質(zhì)代謝、類固醇激素的合成及細(xì)胞的解毒相關(guān)。肝細(xì)胞富含ER, ER也是維持肝細(xì)胞正常功能的重要細(xì)胞器，眾多肝臟致病因素均能破壞ER穩(wěn)態(tài)，從而導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ER stress)。ER stress包括未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)和非UPR兩種途徑。蛋白質(zhì)的不正確折疊和/或錯(cuò)誤折疊引發(fā)的ER stress反應(yīng)稱UP

5、R，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中由3種ER感應(yīng)蛋白介導(dǎo)，即需肌醇酶1(inositol-requiringprotein1，IRE1)、雙鏈RNA依賴的蛋白激酶樣ER激酶（PKR-like ER kinase，PERK）和活化轉(zhuǎn)錄因6(activatingtranscription factor6，ATF6)3種跨膜蛋白。非UPR包括磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositide-3-OH kinase/protein

6、kinase B，PI3K/Akt）、絲裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated proteinkinases，MEK/ERK)、糖原合成酶激酶-3（glycogen synthase kinase-3,GSK-3）、細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear transcription factor，NF-κB)、Tol

7、l樣受體(Toll-like receptor，TLR)等。這些通路分別對(duì)ER stress介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、炎性反應(yīng)以及免疫反應(yīng)有重要影響。早期的ER stress在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)方面起著重要的作用，但是過度的ER stress則會(huì)引起細(xì)胞凋亡，造成細(xì)胞和組織的損害。雖然已經(jīng)有報(bào)道指出，ER stress與NASH肝細(xì)胞脂毒性凋亡密切相關(guān)，但是有關(guān)ER stress在脂毒性凋亡中的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步闡明。因此，本課題運(yùn)用飽和脂肪

8、酸軟脂酸鈉誘導(dǎo)人正常肝細(xì)胞株L02和肝癌細(xì)胞株HepG2建立肝細(xì)胞脂變模型，從ER stress UPR和非UPR入手，研究軟脂酸鈉對(duì)UPR(PERK、IRE1、ATF6)和非UPR（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）信號(hào)通路的影響以及UPR和非UPR信號(hào)途徑對(duì)肝細(xì)胞脂毒性凋亡的調(diào)控作用，進(jìn)而揭示軟脂酸鈉對(duì)肝細(xì)胞脂毒性的作用機(jī)制，這不僅有助于闡明NASH的發(fā)病機(jī)制，也為NASH的治療奠定新的理論基礎(chǔ)。

9、
　　方法:
　　一、軟脂酸鈉誘導(dǎo)L02和HepG2細(xì)胞發(fā)生脂毒性凋亡
　　1.軟脂酸鈉誘導(dǎo)L02和HepG2細(xì)胞建立肝細(xì)胞脂變模型用不同濃度的軟脂酸鈉及不同時(shí)間點(diǎn)(12、24、48h)誘導(dǎo)L02和HepG2細(xì)胞，通過MTT方法檢測細(xì)胞活力，篩選出軟脂酸鈉最佳誘導(dǎo)濃度建模;通過甘油三酯測定、油紅O染色檢測細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量和脂質(zhì)沉積情況。
　　2.軟脂酸鈉誘導(dǎo)脂變L02和HepG2細(xì)胞凋亡通過Annexin V-

10、PE/7-AAD流式細(xì)胞術(shù)、Hoechst33258細(xì)胞凋亡熒光染色以及透射電子顯微鏡檢測脂變模型肝細(xì)胞的凋亡率、觀察凋亡細(xì)胞的形態(tài)變化。
　　二、UPR調(diào)節(jié)軟脂酸鈉誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂毒性凋亡的作用和機(jī)制
　　1.軟脂酸鈉誘導(dǎo)L02和HepG2細(xì)胞后，ER stress標(biāo)志分子表達(dá)及UPR信號(hào)通路的激活情況軟脂酸鈉誘導(dǎo)細(xì)胞0、12、24、48h，收集細(xì)胞，提取胞漿蛋白、核蛋白和總RNA，通過Western blot和RT-PCR方

11、法檢測GRP78、磷酸化PERK(p-PERK)、ATF4和CHOP蛋白以及未剪接型XBP-1(uXBP-1)和剪接型XBP-1（XBP-1s）mRNA的表達(dá)，比較各時(shí)間點(diǎn)上述蛋白和mRNA表達(dá)水平較0h的變化情況。
　　2.沉默PERK基因?qū)浿徕c誘導(dǎo)的PERK/ATF4/CHOP通路阻斷及脂變肝細(xì)胞凋亡的影響將沉默效果最佳的PERK shRNA質(zhì)粒和Control shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染L02和HepG2細(xì)胞24h，再予軟脂酸鈉

12、誘導(dǎo)細(xì)胞48h，收集細(xì)胞，提取胞漿蛋白和核蛋白，通過Western blot、Annexin V-PE/7-AAD流式細(xì)胞術(shù)方法，對(duì)比PERK shRNA+軟脂酸鈉組與Control shRNA+軟脂酸鈉組總PERK(t-PERK)、ATF4和CHOP蛋白表達(dá)水平及細(xì)胞凋亡率的變化。
　　三、GSK-3β(非UPR)調(diào)節(jié)軟脂酸鈉誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂毒性凋亡的作用和可能機(jī)制
　　1.軟脂酸鈉誘導(dǎo)L02和HepG2細(xì)胞后，GSK-3β蛋

13、白的表達(dá)水平以及GSK-3β在脂變肝細(xì)胞凋亡中的作用軟脂酸鈉誘導(dǎo)細(xì)胞0、12、24、48h，收集細(xì)胞，提取胞漿蛋白，Western blot方法檢測磷酸化GSK-3β（p-GSK-3β，Ser9磷酸化）、總 GSK-3β(t-GSK-3β)蛋白的表達(dá)，比較各時(shí)間點(diǎn)p-GSK-3β、t-GSK-3β蛋白的表達(dá)水平較0h的變化情況。
　　GSK-3β特異性抑制劑Lithium chloride與軟脂酸鈉共同誘導(dǎo)（抑制劑組）和軟脂酸鈉誘

14、導(dǎo)（模型組）培養(yǎng)細(xì)胞0、12、24、48h，收集細(xì)胞，通過Western blot、Annexin V-PE/7-AAD流式細(xì)胞術(shù)方法，對(duì)比相同時(shí)間點(diǎn)抑制劑組與模型組p-GSK-3β蛋白表達(dá)水平和細(xì)胞凋亡率的變化。
　　將沉默效果最佳的GSK-3β shRNA質(zhì)粒和Control shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染L02和HepG2細(xì)胞24h，再予軟脂酸鈉誘導(dǎo)細(xì)胞48h，收集細(xì)胞，提取胞漿蛋白和核蛋白，通過Western blot、Annexin

15、 V-PE/7-AAD流式細(xì)胞術(shù)方法，對(duì)比GSK-3β shRNA+軟脂酸鈉組與Control shRNA+軟脂酸鈉組t-GSK-3β蛋白表達(dá)水平及細(xì)胞凋亡率的變化。
　　2.抑制GSK-3β蛋白活性和沉默基因表達(dá)對(duì)軟脂酸鈉誘導(dǎo)的GSK-3β非UPR通路的影響GSK-3β特異性抑制劑Lithium chloride與軟脂酸鈉共同誘導(dǎo)（抑制劑組）和軟脂酸鈉誘導(dǎo)（模型組）培養(yǎng)細(xì)胞0、12、24、48h，收集細(xì)胞，Western blo

16、t方法、Caspase-3分光光度法分別檢測磷酸化JNK(p-JNK)、Bax蛋白表達(dá)和Caspase-3活性，對(duì)比同一時(shí)間點(diǎn)抑制劑組與模型組p-JNK、Bax表達(dá)水平和Caspase-3活性的變化。
　　將沉默效果最佳的GSK-3β shRNA質(zhì)粒和Control shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染L02和HepG2細(xì)胞24h，再予軟脂酸鈉誘導(dǎo)細(xì)胞48h，收集細(xì)胞，提取胞漿蛋白和核蛋白，通過Western blot方法，對(duì)比GSK-3β shR

17、NA+軟脂酸鈉組與Control shRNA+軟脂酸鈉組p-JNK、Bax、GRP78、磷酸化IRE1(p-IRE1)、p-PERK蛋白表達(dá)水平及Caspase-3活性變化。
　　結(jié)果:
　　一、軟脂酸鈉誘導(dǎo)L02和HepG2細(xì)胞發(fā)生脂毒性凋亡
　　1.不同濃度(36、72、108、144、180μtmol/L)的軟脂酸鈉誘導(dǎo)L02和HepG2細(xì)胞12、24h，細(xì)胞存活率變化不明顯;當(dāng)濃度超過72μmol/L誘導(dǎo)細(xì)胞4

18、8h，細(xì)胞存活率較對(duì)照組明顯降低，因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選用接近48h的2/3的IC50濃度(108μmol/L)作為軟脂酸鈉最佳誘導(dǎo)濃度。
　　2.軟脂酸鈉誘導(dǎo)L02和HepG2細(xì)胞12h，細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量和脂質(zhì)沉積變化不明顯;誘導(dǎo)24、48h，細(xì)胞內(nèi)甘油三酯合成增加、脂質(zhì)明顯沉積。
　　3.軟脂酸鈉誘導(dǎo)L02和HepG2細(xì)胞24h，與對(duì)照組比較，細(xì)胞凋亡率無明顯變化;誘導(dǎo)細(xì)胞48h，凋亡率較對(duì)照組明顯增加(P＜0.05)、凋

19、亡細(xì)胞發(fā)生形態(tài)變化、凋亡小體形成。
　　二、UPR調(diào)節(jié)軟脂酸鈉誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂毒性凋亡的作用和機(jī)制
　　1.軟脂酸鈉誘導(dǎo)L02和HepG2細(xì)胞0、12、24、48h，GRP78蛋白的表達(dá)量逐漸增加，與對(duì)照組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2.軟脂酸鈉誘導(dǎo)L02和HepG2細(xì)胞0、12、24、48h，p-PERK、ATF4、CHOP蛋白的表達(dá)量均逐漸增加，與對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);僅

20、HepG2細(xì)胞12h時(shí)uXBP-1 mRNA水平較(O)h(一)過性的升高，在HepG2其它時(shí)間點(diǎn)及L02細(xì)胞中uXBP-1 mRNA水平無明顯變化，并且在各時(shí)間點(diǎn)均未檢測到XBP-ls mRNA表達(dá)。
　　3.構(gòu)建的3組PERK shRNA質(zhì)粒中，PERK1 shRNA質(zhì)粒的沉默效果最佳。沉默L02和HepG2細(xì)胞PERK基因后，與Control shRNA+軟脂酸鈉組比較，PERK shRNA+軟脂酸鈉組t-PERK、ATF4

21、和CHOP蛋白表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4.PERK基因沉默后，PERK shRNA+軟脂酸鈉組細(xì)胞凋亡率較ControlshRNA+軟脂酸鈉組降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　三、GSK-3β（非UPR）調(diào)節(jié)軟脂酸鈉誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂毒性凋亡的作用和可能機(jī)制
　　1.隨著軟脂酸鈉誘導(dǎo)L02和HepG2細(xì)胞時(shí)間(0、12、24、48h)延長，p-GSK-3β表達(dá)逐漸減低，間接反應(yīng)了GS

22、K-3β蛋白的活性逐漸增加，與對(duì)照組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2.與模型組比較，L02和HepG2細(xì)胞抑制劑組p-GSK-3β蛋白表達(dá)明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說明Lithium chloride可以通過增加軟脂酸鈉誘導(dǎo)肝細(xì)胞中p-GSK-3β(Ser9)蛋白的表達(dá)從而抑制GSK-3β活性。抑制劑組肝細(xì)胞凋亡率較模型組顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3.構(gòu)建的3

23、組GSK-3β shRNA質(zhì)粒中，GSK-3β1 shRNA質(zhì)粒的沉默效果最佳。沉默L02和HepG2細(xì)胞GSK-3β基因后，與Control shRNA+軟脂酸鈉組比較，GSK-3β shRNA+軟脂酸鈉組細(xì)胞凋亡率明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4.隨著軟脂酸鈉誘導(dǎo)L02和HepG2細(xì)胞時(shí)間(0、12、24、48h)延長，p-JNK和Bax蛋白表達(dá)以及Caspase-3活性逐漸增加。抑制劑組 p-JNK、B

24、ax蛋白表達(dá)水平和Caspase-3活性均較模型組降低。沉默GSK-3β基因后，與Control shRNA+軟脂酸鈉組比較，GSK-3β shRNA+軟脂酸鈉組p-JNK、Bax蛋白表達(dá)水平和Caspase-3活性降低，以上差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　5.沉默L02和HepG2細(xì)胞GSK-3β基因后，Control shRNA+軟脂酸鈉組GRP78、p-IRE1和p-PERK蛋白表達(dá)較Control shRNA組

25、明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。然而，GSK-3β shRNA+軟脂酸鈉組與Control shRNA+軟脂酸鈉組比較，上述蛋白表達(dá)無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　一、飽和脂肪酸誘導(dǎo)L02和HepG2細(xì)胞發(fā)生脂毒性凋亡。
　　二、PERK/ATF4/CHOP是介導(dǎo)飽和脂肪酸誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂毒性凋亡的主要UPR信號(hào)通路。
　　三、GSK-3β（非UPR）可能通過p-JNK/