肝臟型脂肪酸結(jié)合蛋白介導(dǎo)脂肪酸通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡途徑引起人近端小管上皮細(xì)胞凋亡.pdf

1、目的:蛋白尿是慢性腎臟疾病(Chronic kidney disease，CKD)的共同表現(xiàn)，大量蛋白尿可引起腎小管及間質(zhì)的損傷和炎癥。而與白蛋白(albumin，Alb)結(jié)合的游離脂肪酸(free fat acids，F(xiàn)FAs)通過脂毒性，引起細(xì)胞功能障礙和損傷，參與了腎間質(zhì)損傷的過程。已有研究表明飽和脂肪酸棕櫚酸(Palmitic acids，PA)可誘導(dǎo)非脂肪細(xì)胞的損傷和凋亡。
　　脂毒性包含了多種應(yīng)激反應(yīng)，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和氧

2、化應(yīng)激等。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。但持久強(qiáng)烈的ERS會通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性死亡途徑(ER-associateddeath)，引起細(xì)胞凋亡。
　　肝臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(liver-type fatty acid binding protein，L-FABP/FABP1)是脂肪酸結(jié)合蛋白家族一員，人腎近曲小管上皮細(xì)胞表達(dá)。尿L-FABP被認(rèn)為與腎小管間

3、質(zhì)損傷密切相關(guān)，是監(jiān)測CKD進(jìn)展的標(biāo)志物之一。
　　本課題前期研究表明，油酸(Oleic acids，OA)誘導(dǎo)L-FABP表達(dá)和ERS，并導(dǎo)致HK-2細(xì)胞凋亡。為了進(jìn)一步探討L-FABP與ERS之間的關(guān)系，本研究比較沉默HK-2細(xì)胞L-FABP前后，高PA和OA干預(yù)下的HK-2細(xì)胞，ERS相關(guān)蛋白和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，試圖明確L-FABP在FFA通過ERS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中的作用，為臨床FFAs引起腎小管細(xì)胞凋亡提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。<

4、br>　　方法:1、實(shí)驗(yàn)分組:
　　(1)HK-2細(xì)胞隨機(jī)分為Control，高棕櫚酸(PA)，高油酸(OA)和高蛋白(Alb)干預(yù)組。
　　(2)HK-2細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染shNC或shL-FABP后，分別給予高PA、OA和Alb干預(yù)，并設(shè)立對照組shNC、和shL-FABP。具體實(shí)驗(yàn)分組如下。
　　2、MTT法確定HK-2細(xì)胞50％生存率的PA濃度;
　　3、Western blot法確定PA、OA干預(yù)HK-2細(xì)胞

5、時(shí)間;
　　4、觀察PA、OA和Alb干預(yù)對L-FABP、HK-2細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白及凋亡蛋白表達(dá)的影響;
　　5、觀察轉(zhuǎn)染shL-FABP質(zhì)粒后，PA、OA和Alb干預(yù)對HK-2細(xì)胞中的L-FABP、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白及凋亡蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:
　　1、確定PA對HK-2細(xì)胞的干預(yù)濃度
　　不同濃度PA干預(yù)HK-2細(xì)胞24h，發(fā)現(xiàn)PA濃度為200μmol/L HK-2細(xì)胞生存率為40％，接近5

6、0％。故選取PA濃度200μmol/L為干預(yù)濃度。
　　2、PA干預(yù)HK-2細(xì)胞L-FABP的表達(dá)變化
　　PA分別干預(yù)HK-2細(xì)胞3h，6h，12h，24h和48h的結(jié)果顯示:與干預(yù)前比較，3h，6h和12h L-FABP蛋白表達(dá)無明顯變化，24h表達(dá)達(dá)到峰值，48h表達(dá)減少。
　　3、OA干預(yù)HK-2細(xì)胞L-FABP的表達(dá)變化
　　OA分別干預(yù)HK-2細(xì)胞3h，6h，12h，24h和48h的結(jié)果顯示:與干預(yù)前

7、比較，12h，24h和48h L-FABP蛋白表達(dá)增加，但24h達(dá)到峰值。
　　4、PA、OA和Alb干預(yù)對HK-2細(xì)胞L-FABP蛋白表達(dá)的影響
　　OA組和PA組L-FABP表達(dá)均高于正常對照組，Alb組與Control組無明顯區(qū)別。
　　5、PA、OA和Alb干預(yù)對HK-2細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白及凋亡蛋白表達(dá)的影響
　　OA組和PA組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白和凋亡相關(guān)GRP78、CHOP、Caspase3和Cle

8、ave Caspase3的表達(dá)均高于Control組;Alb組與Control組無明顯區(qū)別。
　　6、shL-FABP質(zhì)粒下調(diào)HK-2細(xì)胞中的L-FABP蛋白表達(dá)水平。
　　熒光結(jié)果顯示，shNC組和shL-FABP組均可捕獲質(zhì)粒所攜帶的綠色熒光。
　　與Control組相比，shL-FABP組HK-2細(xì)胞的L-FABP蛋白的表達(dá)水平明顯降低。
　　7、shL-FABP質(zhì)粒下調(diào)PA和OA誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)

9、激相關(guān)蛋白的高表達(dá)。
　　(1) PA+shNC組與shNC組相比較， GRP78、PERK和p-PERK蛋白的表達(dá)水平明顯增高。敲低L-FABP后，PA+shL-FABP組與PA+shNC組相比較，GRP78、PERK、p-PERK蛋白的表達(dá)水平明顯降低。
　　(2) OA+shNC組與shNC組相比較，GRP78、PERK和p-PERK蛋白的表達(dá)水平明顯增高。敲低L-FABP后，OA+shL-FABP組與OA+shNC組

10、相比較， GRP78、PERK、p-PERK蛋白的表達(dá)水平明顯降低。
　　(3) Alb+shNC組與shNC組相比較，PERK蛋白的表達(dá)水平有所增高，GRP78和p-PERK蛋白的表達(dá)水平無明顯變化。敲低L-FABP后，Alb+shL-FABP組與Alb+shNC組相比較，PERK和p-PERK蛋白的表達(dá)水平有所下降，GRP78蛋白的表達(dá)水平無明顯變化。
　　8、shL-FABP質(zhì)粒下調(diào)PA和OA誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)

11、凋亡蛋白的高表達(dá)。
　　(1) PA+shNC組與shNC組相比較，CHOP、Caspase3和CleaveCaspase3蛋白的表達(dá)水平明顯增高。敲低L-FABP后，PA+shL-FABP組與PA+shNC組相比較，CHOP、Caspase3和Cleave Caspase3蛋白的表達(dá)水平明顯下調(diào)。
　　(2) OA+shNC組與shNC組相比較，CHOP、Caspase3和CleaveCaspase3蛋白的表達(dá)水平明顯增高

12、。敲低L-FABP后，OA+shL-FABP組與OA+shNC組相比較，CHOP、Caspase3和Cleave Caspase3蛋白的表達(dá)水平明顯下調(diào)。
　　(3) Alb+shNC組與shNC組相比較CHOP、Caspase3和CleaveCaspase3蛋白的表達(dá)水平無明顯增高。敲低L-FABP后，Alb+shL-FABP組與Alb+shNC組相比較，CHOP、Caspase3蛋白的表達(dá)水平無明顯下調(diào)，Cleave Casp

13、ase3蛋白表達(dá)水平有所下調(diào)。
　　結(jié)論:
　　1、PA和OA上調(diào)HK-2細(xì)胞L-FABP蛋白，ERS相關(guān)蛋白以及ER相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)，這一結(jié)果證實(shí)OA和PA可誘導(dǎo)L-FABP蛋白表達(dá)，ERS和ER相關(guān)的凋亡的發(fā)生。
　　2、沉默HK-2細(xì)胞的L-FABP，PA和OA干預(yù)上調(diào)的ERS相關(guān)蛋白以及ER相關(guān)凋亡蛋白有意義降低，證實(shí)L-FABP參與了FFAs誘導(dǎo)的ERS，并最終激活細(xì)胞ERS相關(guān)凋亡的發(fā)生。
　　3、高