油酸通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)人近端小管上皮細(xì)胞凋亡和轉(zhuǎn)分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:脂質(zhì)在腎臟細(xì)胞內(nèi)沉積，是許多腎臟疾病的常見病理變化，脂質(zhì)沉積造成細(xì)胞功能受損即所謂的“脂毒性(lipotoxicity)”。在蛋白尿(proteinuria)腎病中，脂毒性在腎小管間質(zhì)損傷過(guò)程中發(fā)揮重要作用，且與腎病預(yù)后相關(guān)。游離脂肪酸（free fatty acids，F(xiàn)FAs），在血液中與白蛋白結(jié)合，通過(guò)腎小球?yàn)V過(guò)膜被近端小管重吸收，F(xiàn)FAs是蛋白尿性腎病小管損傷的一種重要介質(zhì)。肝型脂肪酸結(jié)合蛋白(liver-type fat

2、ty acid binding protein，L-FABP/FABP1)是脂肪酸結(jié)合蛋白(fatty acid-binding protein，F(xiàn)ABP)家族的成員之一，主要在人肝臟、小腸、腎臟及胰腺組織中表達(dá)，參與胞內(nèi)脂肪酸的攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝調(diào)節(jié)。在慢性腎臟疾病的研究中發(fā)現(xiàn)，尿中L-FABP水平與腎小管間質(zhì)損傷的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，已證實(shí)當(dāng)大量蛋白尿時(shí)，是FFAs而不是白蛋白引起腎小管損傷。但FFAs對(duì)腎小管損傷的具體機(jī)制尚不清楚。<

3、br>　　 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)是蛋白質(zhì)合成、折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)的重要細(xì)胞器，是細(xì)胞應(yīng)對(duì)各種應(yīng)激進(jìn)行信息整合的中心。ER為了適應(yīng)正在改變的環(huán)境而形成了一個(gè)未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)的信號(hào)途徑，通過(guò)增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的降解功能使蛋白質(zhì)生物合成減少，來(lái)減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)擔(dān)，維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，增強(qiáng)細(xì)胞適應(yīng)性，及時(shí)有效的逆轉(zhuǎn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum

4、stress，ERS)，但持續(xù)或過(guò)強(qiáng)的UPR將最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。FFAs可通過(guò)ERS引起胰島β細(xì)胞和肝細(xì)胞凋亡;大量蛋白尿時(shí)白蛋白可引起腎小管上皮細(xì)胞ERS。但有關(guān)FFAs是否通過(guò)ERS導(dǎo)致腎臟固有細(xì)胞凋亡的研究尚不多見。
　　 L-FABP作為FFAs的一個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)體，并與其進(jìn)行可逆性結(jié)合完成跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等細(xì)胞器。我們推測(cè)過(guò)多的FFAs轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)引起ERS及小管細(xì)胞凋亡和轉(zhuǎn)分化。本文將試圖通過(guò)對(duì)培養(yǎng)的人近端小管細(xì)胞系

5、（HK-2cells）的研究，用人體血液含量最高的FFAs—油酸(oleicacids，OA)，一種18碳單不飽和脂肪酸作為FFAs的代表，探討FFAs對(duì)腎小管損傷的機(jī)制。
　　 方法:人近端小管上皮細(xì)胞(HK-2)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所。用含有10％胎牛血清，2mmol/1-谷氨酰胺，100IU/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的DMEM-F12培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，用5％C02，37℃的培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。待HK-2達(dá)80％～90

6、％融合后，用無(wú)血清培養(yǎng)基同步細(xì)胞24h。細(xì)胞分組如下:正常對(duì)照組，油酸組和無(wú)游離脂肪酸白蛋白組（以下簡(jiǎn)稱為白蛋白組）。
　　 1、MTT法檢測(cè)不同濃度、不同時(shí)間點(diǎn)油酸和白蛋白的生長(zhǎng)曲線，確定HK-250％生存率時(shí)的濃度及時(shí)間點(diǎn);
　　 2、細(xì)胞常規(guī)爬片，掃描電鏡觀察干預(yù)12h時(shí)HK-2細(xì)胞超微形態(tài)改變;收集干預(yù)12hHK-2細(xì)胞，透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變;
　　 3、細(xì)胞常規(guī)爬片，原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(te

7、rminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay,TUNEL)檢測(cè)干預(yù)12h時(shí)HK-2細(xì)胞凋亡率;
　　 4、提取6h、12h、24h不同干預(yù)條件下HK-2細(xì)胞蛋白，Western Blot檢測(cè)L-FABP、GRP78、GADD153/CHOP、α-SMA、Bcl-2、Bax、Caspase-3和Cleaved Cas

8、pase-3的蛋白表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:
　　 1、干預(yù)12h，HK-2細(xì)胞的50％生存率的油酸濃度是100μmol/l，而無(wú)游離脂肪酸的白蛋白濃度是10mg/ml。
　　 2、不同干預(yù)條件下12h時(shí)HK-2細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變
　　 (1)掃描電鏡觀察，正常對(duì)照組HK-2細(xì)胞間連接緊密，細(xì)胞膜菲薄細(xì)胞核位于中央，核仁明顯，細(xì)胞器圍繞細(xì)胞核周圍;與正常對(duì)照組相比無(wú)游離脂肪酸白蛋白組細(xì)胞皺縮，但細(xì)胞膜完好，細(xì)

9、胞外形呈荷葉狀或輪輻狀;而油酸組細(xì)胞體積縮小胞膜皺縮，細(xì)胞連接松散，細(xì)胞膜有破損，成篩孔狀，出現(xiàn)核裂孔，胞質(zhì)內(nèi)容物明顯增多，有的細(xì)胞器裸露。
　　 (2)透射電鏡觀察，正常對(duì)照組HK-2細(xì)胞發(fā)育良好，與正常對(duì)照組相比無(wú)游離脂肪酸白蛋白組細(xì)胞細(xì)胞器豐富;油酸組細(xì)胞膜破壞崩解，細(xì)胞微絨毛脫落，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，胞漿中可見脂滴和糖原顆粒，并有散在的微絲存在。染色質(zhì)濃染、邊集化，細(xì)胞核呈銳角突起出現(xiàn)了凋亡的早期表現(xiàn)。
　　 3

10、、不同時(shí)間點(diǎn)油酸干預(yù)下HK-2細(xì)胞L-FABP蛋白的表達(dá)
　　 油酸干預(yù)HK-2細(xì)胞1h、3h、6h、12h和24h后，細(xì)胞總蛋白WesternBlot結(jié)果顯示:6h開始表達(dá)上調(diào)，12h達(dá)到峰值，24h表達(dá)有所減低。
　　 4、不同干預(yù)條件下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)
　　 細(xì)胞總蛋白WesternBlot結(jié)果顯示:細(xì)胞干預(yù)6h、12h和24h，三個(gè)時(shí)間點(diǎn)高油酸組和高白蛋白組GRP78和GADD/CHOP表達(dá)均高于

11、正常對(duì)照組;而高油酸組表達(dá)又高于高白蛋白組。
　　 5油酸對(duì)HK-2細(xì)胞凋亡的影響
　　 (1)TUNEL檢測(cè)表明12h時(shí)油酸組凋亡細(xì)胞率顯著高于正常對(duì)照組和白蛋白組，正常對(duì)照組與白蛋白組間沒(méi)有差別;
　　 (2)Western Blot結(jié)果:干預(yù)6h、12h和24h的HK-2細(xì)胞，油酸組Caspase-3和CleavedCaspase-3比正常對(duì)照組和白蛋白組表達(dá)增加，且油酸組Bax/Bcl-2比率較其他兩組高

12、，正常對(duì)照組與白蛋白組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 6、油酸對(duì)HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響
　　 干預(yù)12h的HK-2細(xì)胞，油酸組α-SMA表達(dá)較正常對(duì)照組和白蛋白組表達(dá)增加，而正常對(duì)照組與白蛋白組間無(wú)差別。
　　 結(jié)論:
　　 1、油酸可以上調(diào)HK-2細(xì)胞L-FABP蛋白和ERS相關(guān)蛋白GRP78、GADD/CHOP的表達(dá)，L-FABP的上調(diào)先于ERS相關(guān)蛋白的上調(diào)。我們推測(cè)油酸通過(guò)L-FABP誘發(fā)ERS，

13、并激活ERS相關(guān)的凋亡通路。
　　 2、油酸還可以上調(diào)Caspase-3和Cleaved Caspase-3蛋白，使Bax/Bcl-2比值增加。熒光TUNEL染色證實(shí)OA干預(yù)引起細(xì)胞凋亡。這兩部分結(jié)果說(shuō)明油酸引起的細(xì)胞凋亡至少部分是通過(guò)ERS途徑來(lái)完成的。
　　 3、HK-2細(xì)胞在油酸干預(yù)下無(wú)論在形態(tài)還是功能上均表現(xiàn)出肌纖維母細(xì)胞的特性，說(shuō)明OA干預(yù)導(dǎo)致HK-2細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)分化。
　　 綜合上述，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)油酸既可