石決明水提液通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑保護(hù)晶狀體上皮細(xì)胞氧化損傷的研究.pdf

1、第一章:前期準(zhǔn)備
　　目的：
　　培養(yǎng)人晶狀體上皮細(xì)胞(Human lens epithelial cell，HLEC)，探討衣霉素(tunicamycin，TM)和毒胡蘿卜內(nèi)酯(thapsigargin，TG)誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic Reticulum Stress，ERS)的作用，建立HLEC內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　方法：
　　1.細(xì)胞培養(yǎng):將凍存的人晶狀體上皮細(xì)胞株SRA01/0

2、4復(fù)蘇后，置于含15％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)，進(jìn)行傳代，取3-4代細(xì)胞備下一步實(shí)驗(yàn)。
　　2.實(shí)驗(yàn)分組:將細(xì)胞分為:a.空白組:加入含10％胎牛血清的培養(yǎng)液;b.對(duì)照組1:1umol衣霉素(tunicamycin，TM)+培養(yǎng)液;c.對(duì)照組2:1umol毒胡蘿卜內(nèi)酯(thapsigargin，TG)+培養(yǎng)液;d.給藥組1:1umolTM+200ul0.005％石決明水提液;e.給藥組2:1umolTG+200ul0

3、.005％石決明水提液。作用12小時(shí)后收集細(xì)胞。
　　3.四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法分別測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的情況;
　　4.TUNEL法分別檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組HLEC的細(xì)胞凋亡率。
　　5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((X)±S)表示，采用單因素方差分析，選用LSD法及SNK法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果：
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果:倒置顯微鏡下HLEC呈典型的多邊形、六邊

4、形立方上皮細(xì)胞，貼壁生長(zhǎng)（圖3、4）。
　　2.分組實(shí)驗(yàn)結(jié)果:各組細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài):a組細(xì)胞生長(zhǎng)良好，多數(shù)呈多邊形、六邊形立方上皮細(xì)胞形態(tài)（圖4）;b組和c組大片細(xì)胞呈圓形，表示出現(xiàn)大量凋亡細(xì)胞（圖5）;d組和e組見少量細(xì)胞呈圓形，說(shuō)明凋亡細(xì)胞少（圖6）。
　　3.MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各實(shí)驗(yàn)組HLEC抑制率存在差異(P＜0.05)。兩給藥組抑制率均低于培養(yǎng)液組（表1）。以空白組為對(duì)照，作用12小時(shí)后，對(duì)照組的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率均明顯

5、高于給藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05vs空白組）。
　　4.TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率:TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞核固縮或裂解，在熒光顯微鏡下呈黃綠色，凋亡細(xì)胞可見核小體，細(xì)胞大小不一（圖7）:而TUNEL染色陰性細(xì)胞著色均勻，呈淡綠色，大小均一（圖8）。通過(guò)高倍顯微鏡觀察技術(shù)得出各組晶狀體上皮細(xì)胞凋亡率(％)，將各組HLEC凋亡率變量變換后再進(jìn)行方差分析（表2），給藥組、對(duì)照組和空白組之間兩兩比較均有顯著性差異(P＜0.01)

6、。
　　結(jié)論：
　　1.TM和TG可以誘導(dǎo)HLEC凋亡。TM和TG能夠阻礙糖蛋白的糖基化，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生未折疊蛋白，這類蛋白被認(rèn)為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和未折疊蛋白反應(yīng)的標(biāo)志。
　　2.石決明水提液可以降低HLEC的凋亡。
　　第二章:Westernblot和RT-PCR方法檢測(cè)氧化損傷的HLEC中CHOPmRNA、XBP-1mRNA和GRP78的表達(dá)
　　目的：
　　通過(guò)對(duì)氧化損傷的晶狀體上皮細(xì)胞中CHOPmR

7、NA、XBP-1mRNA及GRP78表達(dá)的檢測(cè)，探討石決明水提液在晶狀體上皮細(xì)胞氧化損傷中的作用。
　　方法：
　　按第一章細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組方法，將各實(shí)驗(yàn)組分別用RT-PCR方法檢測(cè)C/EBP同源蛋白mRNA(C/EBP homologous protein，CHOP)和X盒結(jié)合蛋白-1mRNA(X-box binding protein 1，XBP-1)的表達(dá);用Western blot方法檢測(cè)葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(78-kDa

8、 glucose-regulated protein，GRP78)的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.RT-PCR方法檢測(cè)晶狀體上皮細(xì)胞CHOPmRNA的表達(dá):各組HLEC中均有CHOPmRNA表達(dá)（表3）。對(duì)照組的陽(yáng)性表達(dá)率大于空白組(P＜0.01);給藥組的陽(yáng)性表達(dá)率大于空白組(P＜0.01);給藥組的陽(yáng)性表達(dá)率小于對(duì)照組(P＜0.01)（表4）。
　　2.RT-PCR方法檢測(cè)晶狀體上皮細(xì)胞XBP-1mRNA的表達(dá):各組

9、HLEC中均有XBP-1mRNA的表達(dá)（表5）。對(duì)照組的陽(yáng)性表達(dá)率大于空白組(P＜0.01);給藥組的陽(yáng)性表達(dá)率大于空白組(P＜0.01);給藥組陽(yáng)性表達(dá)率小于對(duì)照組(P＜0.01)（表6）。
　　3.Western blot方法檢測(cè)晶狀體上皮細(xì)胞GRP78的表達(dá):各實(shí)驗(yàn)組平均灰度值見(圖2)。對(duì)照組的陽(yáng)性表達(dá)率大于空白組(P＜0.01);給藥組的陽(yáng)性表達(dá)率大于空白組(P＜0.01);給藥組的陽(yáng)性表達(dá)率小于對(duì)照組(P＜0.01)（