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文檔簡介
1、目的:以過氧化氫損傷HLEB-3細胞為氧化應(yīng)激損傷的模型,觀察氯通道阻斷劑DIDS和NPPB對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的晶狀體上皮細胞HLE-B3損傷的影響,并通過細胞容積調(diào)節(jié)的角度初步探討氯通道阻斷劑對氧化應(yīng)激下HLEB-3保護的作用途徑及其相關(guān)的分子機制。
材料和方法:1.Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件控制下實現(xiàn)時滯拍攝固定視野內(nèi)活細胞圖像分析HLEB-3在低滲刺激下細胞容積的改變,并通過細胞外溶液氯離子置換和氯通道阻
2、斷劑干預(yù)的方式闡明氯通道在RVD中所起到的作用。
2. HLE-B3氧化應(yīng)激損傷模型的建立及氯通道阻斷劑保護作用的觀察,外源性500μmol/L過氧化氫(H2O2)作用于HLEB-3細胞,細胞外溶液氯離子置換及氯通道阻斷劑(NPPB、DIDS)梯度濃度作用于氧化應(yīng)激下HLE B-3細胞,通過光鏡和吖啶橙/溴化乙錠(AO/EB)熒光染色觀察細胞形態(tài)學(xué)及和核形態(tài)改變、MTT法檢測細胞生存力、流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率。
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3、.觀察氧化應(yīng)激下HLEB-3細胞凋亡及凋亡性細胞回縮的變化和氯通道阻斷劑(NPPB、DIDS)干預(yù)的影響。在500μmol/LH2O2作用于HLEB-3細胞的6h內(nèi),通過MTT法檢測細胞生存力,Caspase-3活性檢測及Western Blot法檢測Caspase-3表達水平、DNA瓊脂糖電泳分析、和Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件控制下實現(xiàn)時滯拍攝固定視野內(nèi)活細胞圖像,分析細胞凋亡、Caspase-3表達變化及細胞容積
4、的動態(tài)變化。
結(jié)果:1.在低滲細胞外灌流液作用下,HLEB-3細胞的容積脹大且呈滲透壓相關(guān)性,同時調(diào)節(jié)性容積回縮(RVD)能力增強。通過硝酸根離子取代灌流液中的氯離子方式耗竭細胞內(nèi)氯離子,這時觀察到RVD消失,而用氯通道阻斷劑也可以得到相似結(jié)果。
2.采用不同濃度的氯通道阻斷劑NPPB或DIDS干預(yù)下,細胞存活率呈藥物劑量依賴性升高,其中100μmol/L,200μmol/L這兩個濃度NPPB和DIDS干預(yù)組細胞存活
5、率與H2O2處理組相比較,差異存在顯著性(n=5,P<0.01)。氯通道阻斷劑NPPB(100mol/L)及DIDS(100mol/L)皆可顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的HLE-B3細胞凋亡及細胞容積減少,氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細胞6h后,測得細胞凋亡率為(72.06±2.73)%,加用NPPB及DIDS后,凋亡率則將為(20.78±2.62)%和(15.83±2.57)%。
3.氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞凋亡早期即可觀察到細胞容積減小。在連續(xù)觀察的6
6、h中,細胞容積逐漸減小,6h末細胞容積減少(26.98±2.35)%。氯通道阻斷劑NPPB(100 moL/L)及DIDS(100moL/L)顯著抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)性容積減小,分別為(6.81±0.57)%和(7.03±0.67)%。
結(jié)論:1.Cl-是HLEB-3細胞調(diào)節(jié)性容積回縮(RVD)的關(guān)鍵性離子,Cl-分泌是實現(xiàn)RVD的關(guān)鍵因素,氯通道阻斷劑阻斷氯通道,幾乎完全或大部分阻斷RVD,表明氯通道開放是HLEB-3
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