C2-神經(jīng)酰胺誘導的牛晶狀體上皮細胞的凋亡.pdf

1、背景與目的：
　　白內(nèi)障是目前全球范圍內(nèi)致盲的主要原因,其發(fā)病機制一直是國內(nèi)外學者關注的問題。有研究發(fā)現(xiàn)晶狀體上皮細胞(lens epithelial cells,LECs)的凋亡是導致晶狀體混濁,引起白內(nèi)障形成的一個重要原因。鞘磷脂是維持細胞膜結構的重要組成部分,經(jīng)鞘磷脂酶作用后的產(chǎn)物神經(jīng)酰胺在誘導細胞凋亡的信號轉導過程中具有決定性作用,是衡量細胞凋亡的重要特征性標志之一。
　　神經(jīng)酰胺不僅與血液系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)以及消化系統(tǒng)

2、腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關,而且與其他非腫瘤性疾病的發(fā)生也密切相關。鞘磷脂是晶狀體膜主要的脂質成分,在晶狀體上皮、皮質和核的區(qū)域,已經(jīng)有鞘磷脂酶活性的報道。
　　而且,有學者曾報道白內(nèi)障患者晶狀體中神經(jīng)酰胺的濃度是相同年齡正常晶狀體的四倍。然而,鞘磷脂代謝產(chǎn)物神經(jīng)酰胺在正常LECs中及在白內(nèi)障的發(fā)展過程中的作用還不十分清楚。半胱天冬酶-3(cysteine-requiring aspartate protease-3,caspase-3)

3、是一種凋亡執(zhí)行蛋白酶,位于caspase凋亡級聯(lián)“瀑布”下游,在各種因素啟動的凋亡程序中起最后的樞紐作用。
　　已有報道神經(jīng)酰胺可以誘導caspase依賴性和caspase非依賴性的細胞凋亡。本實驗研究外源性C2-神經(jīng)酰胺對培養(yǎng)的牛晶狀體上皮細胞存活和凋亡的影響;并觀察在此過程中,牛晶狀體上皮細胞中是否存在caspase-3活性的變化。
　　方法：
　　1.C2-神經(jīng)酰胺的配制C2-神經(jīng)酰胺粉劑用無水乙醇配制成400m

4、mol/L儲備液,-20℃保存。給藥時,用DMEM培養(yǎng)液稀釋無水乙醇至終體積分數(shù)≤0.1％。
　　2.牛LECs的原代和傳代培養(yǎng)新鮮牛眼從鄭州屠宰場獲得。無菌條件下取出晶狀體,截取晶狀體前囊,放入含20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中。將前囊剪成約1mm×1mm大小的碎片,均勻分種于25ml培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),每2-3天更換培養(yǎng)液。原代培養(yǎng)的細胞在培養(yǎng)瓶中長滿融合,用2.5g/L胰蛋白酶消化后,按1:2比例傳代,傳代后每3天更換培養(yǎng)液。

5、r>　　3.MTT法測定C2-神經(jīng)酰胺對牛LECs增殖的影響濃度為1×105/ml的牛LECs經(jīng)不同濃度(50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L)C2-神經(jīng)酰胺作用24h,MTT法測量570nm波長OD值,計算細胞抑制率。抑制率=(對照組OD值—實驗組OD值)/對照組OD值×100％。
　　4.TUNEL染色檢測牛LECs的凋亡濃度為1×105/ml的牛LECs經(jīng)不同濃度(25μmol/L、5

6、0μmol/L、100μmol/L)C2-神經(jīng)酰胺作用12h,按照一步法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒說明操作,熒光顯微鏡下每種濃度隨機選取5個100倍視野并采集圖像,用Image-Pro Plus5.0圖像分析軟件進行分析,計算積分光密度,反應細胞凋亡情況。
　　5.Caspase-3活性的測定預先將pNA(10mM)稀釋為200μmol/L,作為標準品。牛LECs經(jīng)不同濃度(25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L

7、)C2-神經(jīng)酰胺作用后,加入裂解液冰浴裂解,并離心收集上清液。按caspase-3活性檢測試劑盒說明操作,于405nm波長檢測OD值,計算caspase-3激活率。caspase-3激活率=(實驗組和對照組OD值/陽性對照組OD值)×100％。
　　6.統(tǒng)計學分析用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以(?)±s表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩組間比較采用q檢驗。以a=0.05為檢驗水準。
　　結果：
　　

8、1.培養(yǎng)的牛LECs形態(tài)學觀察原代牛LECs在接種后24-48h即可見上皮細胞從囊膜組織塊周邊長出,隨后幾天,細胞圍繞囊膜組織塊向外生長,原代細胞從組織塊長出時呈多角形、長梭形,細胞透亮,大小不一。隨著細胞不斷分裂,細胞呈單層生長。約15-18天細胞生長達融合狀態(tài)。經(jīng)胰蛋白酶消化后,傳代培養(yǎng)的細胞為圓形,12h內(nèi)完全貼壁并開始迅速增殖,約6-8天長滿融合,細胞形態(tài)與原代無明顯差別。
　　2.細胞抑制率的測定結果C2-神經(jīng)酰胺對牛L

9、ECs的半數(shù)抑制濃度(IC50)位于50μmol/L~100μmol/L的濃度區(qū)間內(nèi),因此選擇100μmol/L為隨后實驗的濃度上限。作用時間達12h時,細胞抑制率下降顯著,因此選取12h作為隨后實驗的時間上限。
　　3.細胞凋亡的測定結果TUNEL熒光染色后,凋亡細胞被標記綠色熒光。隨著C2-神經(jīng)酰胺濃度的增加,凋亡細胞的積分光密度也隨之增大(P<0.01),C2-神經(jīng)酰胺誘導的牛LECs的凋亡呈劑量依賴關系。
　　4.C