C2-神經(jīng)酰胺誘導(dǎo)的牛晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡.pdf

1、背景與目的：
　　白內(nèi)障是目前全球范圍內(nèi)致盲的主要原因,其發(fā)病機(jī)制一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的問題。有研究發(fā)現(xiàn)晶狀體上皮細(xì)胞(lens epithelial cells,LECs)的凋亡是導(dǎo)致晶狀體混濁,引起白內(nèi)障形成的一個(gè)重要原因。鞘磷脂是維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的重要組成部分,經(jīng)鞘磷脂酶作用后的產(chǎn)物神經(jīng)酰胺在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中具有決定性作用,是衡量細(xì)胞凋亡的重要特征性標(biāo)志之一。
　　神經(jīng)酰胺不僅與血液系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)以及消化系統(tǒng)

2、腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān),而且與其他非腫瘤性疾病的發(fā)生也密切相關(guān)。鞘磷脂是晶狀體膜主要的脂質(zhì)成分,在晶狀體上皮、皮質(zhì)和核的區(qū)域,已經(jīng)有鞘磷脂酶活性的報(bào)道。
　　而且,有學(xué)者曾報(bào)道白內(nèi)障患者晶狀體中神經(jīng)酰胺的濃度是相同年齡正常晶狀體的四倍。然而,鞘磷脂代謝產(chǎn)物神經(jīng)酰胺在正常LECs中及在白內(nèi)障的發(fā)展過程中的作用還不十分清楚。半胱天冬酶-3(cysteine-requiring aspartate protease-3,caspase-3)

3、是一種凋亡執(zhí)行蛋白酶,位于caspase凋亡級(jí)聯(lián)“瀑布”下游,在各種因素啟動(dòng)的凋亡程序中起最后的樞紐作用。
　　已有報(bào)道神經(jīng)酰胺可以誘導(dǎo)caspase依賴性和caspase非依賴性的細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)研究外源性C2-神經(jīng)酰胺對(duì)培養(yǎng)的牛晶狀體上皮細(xì)胞存活和凋亡的影響;并觀察在此過程中,牛晶狀體上皮細(xì)胞中是否存在caspase-3活性的變化。
　　方法：
　　1.C2-神經(jīng)酰胺的配制C2-神經(jīng)酰胺粉劑用無水乙醇配制成400m

4、mol/L儲(chǔ)備液,-20℃保存。給藥時(shí),用DMEM培養(yǎng)液稀釋無水乙醇至終體積分?jǐn)?shù)≤0.1％。
　　2.牛LECs的原代和傳代培養(yǎng)新鮮牛眼從鄭州屠宰場(chǎng)獲得。無菌條件下取出晶狀體,截取晶狀體前囊,放入含20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中。將前囊剪成約1mm×1mm大小的碎片,均勻分種于25ml培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),每2-3天更換培養(yǎng)液。原代培養(yǎng)的細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中長(zhǎng)滿融合,用2.5g/L胰蛋白酶消化后,按1:2比例傳代,傳代后每3天更換培養(yǎng)液。

5、r>　　3.MTT法測(cè)定C2-神經(jīng)酰胺對(duì)牛LECs增殖的影響濃度為1×105/ml的牛LECs經(jīng)不同濃度(50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L)C2-神經(jīng)酰胺作用24h,MTT法測(cè)量570nm波長(zhǎng)OD值,計(jì)算細(xì)胞抑制率。抑制率=(對(duì)照組OD值—實(shí)驗(yàn)組OD值)/對(duì)照組OD值×100％。
　　4.TUNEL染色檢測(cè)牛LECs的凋亡濃度為1×105/ml的牛LECs經(jīng)不同濃度(25μmol/L、5

6、0μmol/L、100μmol/L)C2-神經(jīng)酰胺作用12h,按照一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明操作,熒光顯微鏡下每種濃度隨機(jī)選取5個(gè)100倍視野并采集圖像,用Image-Pro Plus5.0圖像分析軟件進(jìn)行分析,計(jì)算積分光密度,反應(yīng)細(xì)胞凋亡情況。
　　5.Caspase-3活性的測(cè)定預(yù)先將pNA(10mM)稀釋為200μmol/L,作為標(biāo)準(zhǔn)品。牛LECs經(jīng)不同濃度(25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L

7、)C2-神經(jīng)酰胺作用后,加入裂解液冰浴裂解,并離心收集上清液。按caspase-3活性檢測(cè)試劑盒說明操作,于405nm波長(zhǎng)檢測(cè)OD值,計(jì)算caspase-3激活率。caspase-3激活率=(實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組OD值/陽性對(duì)照組OD值)×100％。
　　6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以(?)±s表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩組間比較采用q檢驗(yàn)。以a=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　結(jié)果：
　　

8、1.培養(yǎng)的牛LECs形態(tài)學(xué)觀察原代牛LECs在接種后24-48h即可見上皮細(xì)胞從囊膜組織塊周邊長(zhǎng)出,隨后幾天,細(xì)胞圍繞囊膜組織塊向外生長(zhǎng),原代細(xì)胞從組織塊長(zhǎng)出時(shí)呈多角形、長(zhǎng)梭形,細(xì)胞透亮,大小不一。隨著細(xì)胞不斷分裂,細(xì)胞呈單層生長(zhǎng)。約15-18天細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)融合狀態(tài)。經(jīng)胰蛋白酶消化后,傳代培養(yǎng)的細(xì)胞為圓形,12h內(nèi)完全貼壁并開始迅速增殖,約6-8天長(zhǎng)滿融合,細(xì)胞形態(tài)與原代無明顯差別。
　　2.細(xì)胞抑制率的測(cè)定結(jié)果C2-神經(jīng)酰胺對(duì)牛L

9、ECs的半數(shù)抑制濃度(IC50)位于50μmol/L~100μmol/L的濃度區(qū)間內(nèi),因此選擇100μmol/L為隨后實(shí)驗(yàn)的濃度上限。作用時(shí)間達(dá)12h時(shí),細(xì)胞抑制率下降顯著,因此選取12h作為隨后實(shí)驗(yàn)的時(shí)間上限。
　　3.細(xì)胞凋亡的測(cè)定結(jié)果TUNEL熒光染色后,凋亡細(xì)胞被標(biāo)記綠色熒光。隨著C2-神經(jīng)酰胺濃度的增加,凋亡細(xì)胞的積分光密度也隨之增大(P<0.01),C2-神經(jīng)酰胺誘導(dǎo)的牛LECs的凋亡呈劑量依賴關(guān)系。
　　4.C