Eaf2對(duì)紫外線誘導(dǎo)的鼠晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、目的：
　　本課題擬采用紫外線照射誘導(dǎo)的白內(nèi)障模型小鼠，利用實(shí)時(shí)定量PCR、Western blot、TUNEL等實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段，研究Eaf2基因敲除對(duì)紫外線照射誘導(dǎo)的小鼠晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的影響及其可能的作用機(jī)理。
　　方法：
　　1、分別構(gòu)建Eaf2基因過表達(dá)載體和干擾載體
　　2、過表達(dá)和干擾Eaf2晶狀體上皮細(xì)胞系的建立
　　3、RT-PCR測(cè)定各組細(xì)胞mRNA的轉(zhuǎn)錄水平
　　4、Western

2、 Blot檢測(cè)各組細(xì)胞蛋白的表達(dá)情況
　　5、TUNEL測(cè)定各組細(xì)胞凋亡情況
　　6、紫外線(UV)輻射晶狀體
　　實(shí)驗(yàn)所用紫外線波長(zhǎng)為302nm，強(qiáng)度為200W/cm2，將紫外透射光源用錫箔紙覆蓋，只留有一個(gè)直徑5mm的小孔。紫外線照射時(shí)，不對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉，直接照射。只對(duì)每只小鼠的右眼進(jìn)行照射，左眼作為對(duì)照，不進(jìn)行紫外線的照射。于紫外線照射前5分鐘，對(duì)每只小鼠的右眼進(jìn)行復(fù)方托吡卡胺散瞳。紫外線照射每周進(jìn)行兩次，每次持

3、續(xù)100 s，共照射3周時(shí)間（總共1200 mJ/cm2）。
　　7、TUNEL測(cè)定不同樣本組織細(xì)胞凋亡
　　8、Caspase3、Caspase9活性測(cè)定及Western Blot分析
　　9、裂隙燈觀察晶狀體混濁程度變化
　　最后一次紫外線輻射后48小時(shí)后，裂隙燈檢查小鼠晶狀體混濁程度，利用晶狀體混濁分類系統(tǒng)Ⅱ(lens opacities classification systemⅡ，LOCSⅡ)對(duì)晶狀體混

4、濁程度進(jìn)行分級(jí)，晶狀體皮質(zhì)完全透明為0級(jí)，少量點(diǎn)狀混濁為1級(jí)，點(diǎn)狀混濁擴(kuò)大，瞳孔區(qū)出現(xiàn)少量點(diǎn)狀混濁為2級(jí)，車輪狀混濁，超過兩個(gè)象限為3級(jí)，車輪狀混濁擴(kuò)大，瞳孔區(qū)約50％的混濁為4級(jí)，瞳孔區(qū)90％的混濁為5級(jí)
　　10、暗室野顯微鏡觀察晶狀體混濁程度變化
　　裂隙燈檢查后，斷頸處死小鼠摘取晶狀體以進(jìn)行暗視野顯微鏡照相，根據(jù)所拍攝的圖像，利用Image J軟件對(duì)白內(nèi)障區(qū)域比例進(jìn)行分析，白內(nèi)障區(qū)域比例(cataract area

5、ratio)=白內(nèi)障區(qū)域面積/前囊膜(anterior capsules)區(qū)域面積。
　　結(jié)果：
　　1、Eaf2 OE提高了Eaf2的表達(dá)水平，Eaf2shRNA降低了Eaf2的表達(dá)水平。
　　構(gòu)建Eaf2OE質(zhì)粒和Eaf2shRNA質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)染晶狀體上皮細(xì)胞，通過qRT-PCR和Western Blot來檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。qRT-PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染Eaf2OE后晶狀體上皮細(xì)胞中Eaf2 mRNA的表達(dá)量顯著升高;We

6、stern Blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染Eaf2OE后Eaf2蛋白表達(dá)水平顯著升高;這兩項(xiàng)結(jié)果表明在晶狀體上皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Eaf2OE能夠有效地增加Eaf2的表達(dá)水平。相反，qRT-PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染Eaf2shRNA后晶狀體上皮細(xì)胞中Eaf2 mRNA的表達(dá)量顯著降低;Western Blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染Eaf2shRNA后Eaf2蛋白表達(dá)水平顯著降低;這兩項(xiàng)結(jié)果表明在晶狀體上皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Eaf2shRNA能夠有效地降低Eaf2的表達(dá)水平。

7、r>　　2、TUNEL法測(cè)試各組樣本晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的情況
　　利用TUNEL試劑盒測(cè)試了各組小鼠晶狀體組織樣本中細(xì)胞凋亡的情況。結(jié)果顯示Eaf2OE組引起晶狀體上皮細(xì)胞發(fā)生明顯的凋亡現(xiàn)象，而在Control、Vector、Eaf2shRNA、NC組的樣本中可見散在幾個(gè)凋亡細(xì)胞。在Eaf2shRNA組與NC組之間，兩者的細(xì)胞凋亡水平未見明顯差別。
　　3、在晶狀體上皮細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染Eaf2OE和Eaf2shRNA后對(duì)cle

8、aved-Caspase3、cleaved-Caspase9和cleaved-PARP蛋白質(zhì)的表達(dá)情況
　　通過Western Blot技術(shù)我們測(cè)定了各組中cleaved-Caspase3、cleaved-Caspase9和cleaved-PARP蛋白質(zhì)的表達(dá)量情況。轉(zhuǎn)染Eaf2OE的晶狀體上皮細(xì)胞中上述三種蛋白的表達(dá)量顯著提高;相反，轉(zhuǎn)染Eaf2shRNA的晶狀體上皮細(xì)胞中上述三種蛋白的表達(dá)量明顯降低，這表明Eaf2基因能夠促進(jìn)

9、Caspase3、Caspase9和PARP的激活，從而促進(jìn)凋亡。
　　4、在晶狀體上皮細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染Eaf2OE和Eaf2shRNA后對(duì)Bax和Bcl-2蛋白質(zhì)表達(dá)水平的比較
　　利用Western Blot技術(shù)我們檢測(cè)了Bax和Bcl-2蛋白在各組的表達(dá)差異。在轉(zhuǎn)染Eaf2OE質(zhì)粒的晶狀體上皮細(xì)胞中，Bax蛋白的表達(dá)量顯著提高，而Bcl-2蛋白的表達(dá)量明顯降低;相反，在轉(zhuǎn)染Eaf2shRNA質(zhì)粒的晶狀體上皮細(xì)胞中，bax

10、蛋白的表達(dá)量顯著降低，而Bcl-2蛋白的表達(dá)量明顯提高，這表明Eaf2基因可能通過影響凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)而促進(jìn)凋亡。
　　5、紫外線輻射可以誘導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡
　　利用TUNEL試劑盒測(cè)試了各組小鼠樣本晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的情況。結(jié)果顯示紫外線輻射會(huì)引起晶狀體上皮細(xì)胞發(fā)生明顯的凋亡現(xiàn)象，同時(shí)在未接受紫外線輻射的樣本中幾乎沒有發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞。在WT-UV組與Eaf2 KO-UV組之間，前者表現(xiàn)出更加顯著的細(xì)胞凋亡水平。

11、r>　　6、Eaf2蛋白質(zhì)會(huì)提高細(xì)胞內(nèi)Caspase3和Caspase9蛋白酶活性
　　Caspase3和Caspase9是含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶家族中的重要成員，它們是凋亡過程中不可逆的節(jié)點(diǎn)。Caspase3和Caspase9蛋白酶活性測(cè)定顯示出紫外線輻射會(huì)顯著增加這兩種蛋白水解酶的活性，并且在相同的紫外線劑量輻射下，Caspase3和Caspase9蛋白酶活性在WT-UV組顯著高于Eaf2 KO-UV組的數(shù)據(jù)。通過Ca

12、spase3和Caspase9蛋白酶活性的檢測(cè)，表明Eaf2蛋白質(zhì)的表達(dá)會(huì)加劇紫外線誘發(fā)的晶狀體上皮細(xì)胞凋亡。
　　7、Eaf2蛋白質(zhì)能夠影響凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況
　　Eaf2蛋白質(zhì)能夠增加Bax的表達(dá)，降低Bcl-2的表達(dá)。Western blot法測(cè)定各組樣本中Bax，Bcl-2這兩種蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)水平，結(jié)果:WT-UV組和Eaf2KO-UV組的Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著提高(P＜0.05)，其中WT-UV組高于Ea

13、f2KO-UV組(P＜0.05);WT-UV組的Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量比WT-nonUV組顯著降低（P＜0.05），Eaf2 KO-UV組輕度降低(P＜0.05)。通過這兩種凋亡相關(guān)蛋白的檢測(cè)，提示Eaf2蛋白質(zhì)對(duì)紫外線誘導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡具有促進(jìn)作用。
　　8、Eaf2蛋白質(zhì)能夠激活ERK信號(hào)通路
　　Western blot法測(cè)定各組樣本中ERK及p-ERK的相對(duì)表達(dá)水平，結(jié)果顯示:四組樣本中ERK蛋白表達(dá)水平相似

14、(P＞0.05); WT-UV組的p-ERK蛋白相對(duì)表達(dá)量比WT-nonUV組顯著降低(P＜0.05)，Eaf2 KO-UV組輕度降低(P＜0.05)。通過對(duì)ERK及p-ERK的檢測(cè)，提示Eaf2蛋白質(zhì)能夠激活ERK信號(hào)通路。
　　9、裂隙燈顯微鏡觀察小鼠白內(nèi)障的形成
　　裂隙燈顯微鏡觀察晶狀體混濁程度的小鼠眼球前節(jié)照相:A圖顯示W(wǎng)T-UV;B圖顯示Eaf2KO-UV;C圖顯示W(wǎng)T-nonUV;D圖顯示Eaf2KO-nonU

15、V.圖中可以觀察到A組和B組晶狀體均可見明顯晶狀體皮質(zhì)混濁，C組和D組可見少量點(diǎn)狀晶狀體皮質(zhì)混濁，根據(jù)晶狀體混濁分類系統(tǒng)Ⅱ(lens opacities classification systemⅡ，LOCSⅡ)對(duì)晶狀體混濁程度進(jìn)行分級(jí)，A圖為4級(jí)，B圖為3級(jí)，C圖及D圖為1級(jí)。所有樣本進(jìn)行秩和檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果為:WT-UV組及Eaf2KO-UV組晶狀體混濁程度明顯高于WT-nonUV組及Eaf2KO-nonUV組，其中WT-UV組明顯高于

16、Eaf2KO-UV組，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　10、暗視野顯微鏡觀察小鼠白內(nèi)障的形成
　　暗室野顯微鏡觀察晶狀體混濁面積:A圖顯示W(wǎng)T-UV;B圖顯示Eaf2KO-UV;C圖顯示W(wǎng)T-nonUV;D圖顯示Eaf2KO-nonUV.圖中可以觀察到A組和B組晶狀體可見明顯晶狀體皮質(zhì)混濁，C組和D組未見明顯晶狀體皮質(zhì)混濁，其中圖中A圖中白內(nèi)障的面積占整個(gè)前囊膜面積比例的59.2％，B圖為25.4％，C圖為0％，D圖

17、為0％。所有樣本的均值統(tǒng)計(jì)結(jié)果為:WT-UV組白內(nèi)障面積比例為57.9％±11.2％，Eaf2KO-UV組為27.8％±10.7％，WT-nonUV組為3.8％±1.7％，Eaf2KO-nonUV組為2.8％±1.4％。WT-UV組及Eaf2KO-UV組晶狀體混濁面積明顯高于WT-nonUV組及Eaf2KO-nonUV組，其中WT-UV組明顯高于Eaf2KO-UV組，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、在

18、晶狀體上皮細(xì)胞中可有效地轉(zhuǎn)染Eaf2OE質(zhì)粒及Eaf2shRNA質(zhì)粒。
　　2、在體外實(shí)驗(yàn)中Eaf2蛋白質(zhì)具有促進(jìn)晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的能力。
　　3、紫外線輻射可以誘導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡。
　　4、Eaf2蛋白質(zhì)對(duì)紫外線誘導(dǎo)的晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡具有促進(jìn)作用。
　　5、Eaf2蛋白對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用可能是通過影響ERK信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)的。
　　6、紫外線輻射能夠?qū)е滦∈蟀變?nèi)障的形成。