星狀孢菌素在近紫外線輻射時對兔晶狀體上皮細胞通訊功能的保護作用及其機制.pdf

1、目的： 近年來晶狀體縫隙連接介到的胞間通訊(Gap junction intercellularcommunication，GJIC)異常已經(jīng)作為白內(nèi)障的重要病因而逐漸受到重視。縫隙連接是存在于相鄰細胞間，由縫隙連接蛋白(Connexin，Cx)六聚體組成的細胞間連接，它是細胞間無機離子、水溶性小分子、代謝產(chǎn)物和電化學(xué)交流的直接通道。流行病學(xué)證據(jù)表明，長期慢性的紫外線，尤其是波長為320nm-40nm的長波紫外線，又稱近紫外線，

2、主要由晶狀體吸收，因此近紫外線的輻射與年齡相關(guān)性白內(nèi)障的發(fā)生可能有非常密切的關(guān)系，但機制尚未完全明確，有學(xué)者通過研究已經(jīng)證實近紫外線、微波輻射[1]等相關(guān)理化因素可以導(dǎo)致晶狀體發(fā)生混濁。本研究中，我們引入蛋白激酶C(Protein kinase C，PKC)抑制劑星狀孢菌素(Staurosporine，ST)，旨在探討近紫外線輻射損傷時，星狀孢菌素是否對晶狀體上皮細胞通訊功能有保護作用，以期進一步證實近紫外線輻射引發(fā)白內(nèi)障，系通過激活P

3、KC途徑引起GJIC功能下降所致，從而深入探討近紫外線輻射導(dǎo)致白內(nèi)障發(fā)病的機制，為以后白內(nèi)障的藥物防治提供一條新的線索。 方法： 1.兔晶狀體上皮細胞的原代培養(yǎng)及設(shè)立實驗分組：健康成年無眼疾家兔靜脈空氣栓塞處死后，取出眼球后消毒，截取前囊膜修剪成數(shù)片，Ⅰ型膠原酶消化后接種，10-12 h后第一次換液，后每2 d換液，7-10 d晶體細胞可長滿大部分瓶底，并行傳代，取第2-3代細胞用于實驗研究。預(yù)實驗選取星狀孢菌素的合適藥

4、物濃度，確定近紫外線光源的輻射能量，設(shè)立正常組，實驗組和對照組。 2.晶狀體上皮細胞通訊功能的評定：應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡，通過熒光光漂白恢復(fù)技術(shù)，分別檢測正常組，實驗組和對照組的晶狀體上皮細胞的熒光恢復(fù)率，以評定細胞通訊功能狀態(tài)。 3.縫隙連接蛋白Cx43表達的檢測：應(yīng)用Western-blot方法，從翻譯水平檢測各個組Cx43蛋白表達情況。 4.縫隙連接蛋白Cx43定位的檢測：采用細胞間接免疫熒光化學(xué)技術(shù)，對晶

5、狀體上皮細胞Cx43蛋白進行定位分析。 結(jié)果： 1.星狀孢菌素實驗濃度的確定為10-7mol/L：預(yù)實驗中選取了5個濃度分別作用于的晶狀體上皮細胞后，置于倒置致顯微鏡下觀察，并行臺盼藍染色陽性細胞計數(shù)，高濃度10-4mol/L星狀孢菌素可以迅速誘導(dǎo)細胞10分鐘內(nèi)大量死亡，2小時后崩解為細胞碎片，隨著星狀孢菌素濃度的下降，臺盼藍染色陽性率逐漸下降，降至10-7mol/L時其染色陽性率已經(jīng)與正常對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

6、 2.熒光光漂白恢復(fù)率的測定：正常組，實驗組和對照組細胞平均熒光恢復(fù)率經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，三組兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，實驗組低于正常組，高于對照組。 3.Western-blot結(jié)果：Cx43蛋白在正常組，實驗組和對照組的晶狀體上皮細胞中均有表達，正常對照組為高表達，實驗組表達低于正常組，對照組表達量最低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。 4.Cx43熒光標(biāo)記定位結(jié)果：近紫外線照射后正常定位于晶狀體上皮細胞膜上的Cx43發(fā)生了內(nèi)移，實驗組內(nèi)