星狀孢菌素在近紫外線輻射時(shí)對(duì)兔晶狀體上皮細(xì)胞通訊功能的保護(hù)作用及其機(jī)制.pdf

1、目的： 近年來(lái)晶狀體縫隙連接介到的胞間通訊(Gap junction intercellularcommunication，GJIC)異常已經(jīng)作為白內(nèi)障的重要病因而逐漸受到重視?？p隙連接是存在于相鄰細(xì)胞間，由縫隙連接蛋白(Connexin，Cx)六聚體組成的細(xì)胞間連接，它是細(xì)胞間無(wú)機(jī)離子、水溶性小分子、代謝產(chǎn)物和電化學(xué)交流的直接通道。流行病學(xué)證據(jù)表明，長(zhǎng)期慢性的紫外線，尤其是波長(zhǎng)為320nm-40nm的長(zhǎng)波紫外線，又稱近紫外線，

2、主要由晶狀體吸收，因此近紫外線的輻射與年齡相關(guān)性白內(nèi)障的發(fā)生可能有非常密切的關(guān)系，但機(jī)制尚未完全明確，有學(xué)者通過(guò)研究已經(jīng)證實(shí)近紫外線、微波輻射[1]等相關(guān)理化因素可以導(dǎo)致晶狀體發(fā)生混濁。本研究中，我們引入蛋白激酶C(Protein kinase C，PKC)抑制劑星狀孢菌素(Staurosporine，ST)，旨在探討近紫外線輻射損傷時(shí)，星狀孢菌素是否對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞通訊功能有保護(hù)作用，以期進(jìn)一步證實(shí)近紫外線輻射引發(fā)白內(nèi)障，系通過(guò)激活P

3、KC途徑引起GJIC功能下降所致，從而深入探討近紫外線輻射導(dǎo)致白內(nèi)障發(fā)病的機(jī)制，為以后白內(nèi)障的藥物防治提供一條新的線索。 方法： 1.兔晶狀體上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)及設(shè)立實(shí)驗(yàn)分組：健康成年無(wú)眼疾家兔靜脈空氣栓塞處死后，取出眼球后消毒，截取前囊膜修剪成數(shù)片，Ⅰ型膠原酶消化后接種，10-12 h后第一次換液，后每2 d換液，7-10 d晶體細(xì)胞可長(zhǎng)滿大部分瓶底，并行傳代，取第2-3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。預(yù)實(shí)驗(yàn)選取星狀孢菌素的合適藥

4、物濃度，確定近紫外線光源的輻射能量，設(shè)立正常組，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。 2.晶狀體上皮細(xì)胞通訊功能的評(píng)定：應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡，通過(guò)熒光光漂白恢復(fù)技術(shù)，分別檢測(cè)正常組，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的晶狀體上皮細(xì)胞的熒光恢復(fù)率，以評(píng)定細(xì)胞通訊功能狀態(tài)。 3.縫隙連接蛋白Cx43表達(dá)的檢測(cè)：應(yīng)用Western-blot方法，從翻譯水平檢測(cè)各個(gè)組Cx43蛋白表達(dá)情況。 4.縫隙連接蛋白Cx43定位的檢測(cè)：采用細(xì)胞間接免疫熒光化學(xué)技術(shù)，對(duì)晶

5、狀體上皮細(xì)胞Cx43蛋白進(jìn)行定位分析。 結(jié)果： 1.星狀孢菌素實(shí)驗(yàn)濃度的確定為10-7mol/L：預(yù)實(shí)驗(yàn)中選取了5個(gè)濃度分別作用于的晶狀體上皮細(xì)胞后，置于倒置致顯微鏡下觀察，并行臺(tái)盼藍(lán)染色陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，高濃度10-4mol/L星狀孢菌素可以迅速誘導(dǎo)細(xì)胞10分鐘內(nèi)大量死亡，2小時(shí)后崩解為細(xì)胞碎片，隨著星狀孢菌素濃度的下降，臺(tái)盼藍(lán)染色陽(yáng)性率逐漸下降，降至10-7mol/L時(shí)其染色陽(yáng)性率已經(jīng)與正常對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

6、 2.熒光光漂白恢復(fù)率的測(cè)定：正常組，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞平均熒光恢復(fù)率經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，三組兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，實(shí)驗(yàn)組低于正常組，高于對(duì)照組。 3.Western-blot結(jié)果：Cx43蛋白在正常組，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的晶狀體上皮細(xì)胞中均有表達(dá)，正常對(duì)照組為高表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組表達(dá)低于正常組，對(duì)照組表達(dá)量最低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4.Cx43熒光標(biāo)記定位結(jié)果：近紫外線照射后正常定位于晶狀體上皮細(xì)胞膜上的Cx43發(fā)生了內(nèi)移，實(shí)驗(yàn)組內(nèi)