高糖對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞中NF-κB的作用.pdf

1、目的:糖尿病性白內(nèi)障(Diabetic cataract)是糖尿病患者失明的主要因素之一。臨床觀察表明,糖尿病患者的老年性白內(nèi)障發(fā)病率更高,發(fā)病年齡較非糖尿病者更為提前,而且成熟更為迅速,即糖尿病因素可以使白內(nèi)障提早出現(xiàn)或加速其發(fā)展。然而,目前糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。近年來一系列基礎(chǔ)和臨床研究顯示,糖尿病情況下存在著明顯的氧化應(yīng)激,氧化應(yīng)激是晶狀體上皮細(xì)胞損傷的重要因素。
　　 本實(shí)驗(yàn)小組前期研究結(jié)果顯示,糖尿病時(shí)

2、,大鼠晶狀體上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)mRNA和蛋白表達(dá)明顯上調(diào),iNOS活性顯著增高,其合成的一氧化氮(nitric oxide,NO)大量增加。過量產(chǎn)生的NO與超氧陰離子(superoxide,O2-)快速反應(yīng)生成過氧亞硝基陰離子(peroxynitrite,ONOO-)。ONOO-可有效硝基化蛋白質(zhì)的酪氨酸殘基,形成3-硝基酪氨酸(3-nitrotyro

3、sine,3-NT)。3-NT被公認(rèn)為ONOO-形成的特異性標(biāo)志。蛋白質(zhì)被ONOO-硝基化后,它們的結(jié)構(gòu)和功能就會(huì)受到影響,增強(qiáng)或抑制則取決于不同的蛋白質(zhì)。
　　 本實(shí)驗(yàn)小組前期試驗(yàn)證明,糖尿病中,ONOO-可引起iNOS和環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)的蛋白質(zhì)硝基化,加重對(duì)糖尿病血管的損傷。已知NF-κB是iNOS的上游調(diào)控因子,目前發(fā)現(xiàn)NF-κB家族存在5種蛋白,包括p65(Rel-A),c-R

4、el,Rel-B,p50(其前體蛋白為p105)和p52(其前體蛋白為p100)。NF-κB蛋白家族通常以同源或異源二聚體形式存在,其中p50-p65二聚體是最廣泛的存在形式。當(dāng)細(xì)胞處于未受刺激時(shí),p50-p65二聚體與NF-κB抑制蛋白(Inhibitory kappa B protein,IrB)以三聚體的形式結(jié)合在一起,使NF-κB處于一種無活性狀態(tài),滯留于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到高糖刺激時(shí),IKB激酶復(fù)合物(I-kappa B ki

5、nase complex,IKK)被激活,IκB的N-端被磷酸化,于是NF-κB得以被激活,移位進(jìn)入細(xì)胞核,與DNA鏈上的特異κB序列結(jié)合,從而發(fā)揮調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的活性。那么,在高糖狀態(tài)下,晶狀體上皮細(xì)胞中NF-κB的核轉(zhuǎn)位、核內(nèi)蛋白含量及其硝基化水平如何?關(guān)于這方面的研究尚未見報(bào)道。
　　 3-嗎啉-斯德酮亞胺(3-morpholinosydnonimine,SIN-1)是ONOO-的特異供體。
　　 四磺基苯基鐵卟啉<

6、br>　　 (5,10,15,20-Tetrakis-(4-sulfonatophenyl)porphyrinato-iron(Ⅲ),FeTPPS)是ONOO-的分解催化劑。
　　 本實(shí)驗(yàn)采用人晶狀體上皮細(xì)胞株SRA01/04,應(yīng)用高糖模擬糖尿病高糖狀態(tài)模型,從細(xì)胞水平,應(yīng)用不同濃度的葡萄糖、ONOO-的供體SIN-1、ONOO-的分解催化劑FeTPPS進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中,以NF-κBp65亞基為檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)來測(cè)定NF-κB的核轉(zhuǎn)位

7、、核內(nèi)蛋白含量及其硝基化水平,從而為進(jìn)一步研究硝基化對(duì)NF-κB與DNA結(jié)合活性及對(duì)NF-κB靶基因(如iNOS和COX-2)活性的影響奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1細(xì)胞培養(yǎng)
　　 配置低糖DMEM培養(yǎng)基和0.25％的胰蛋白酶消化液,用含10％新生牛血清和1％非必需氨基酸的低糖DMEM培養(yǎng)基,在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和傳代。
　　 2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分組
　　 2.1探討高糖(25m

8、mol/L)對(duì)SRA01/04細(xì)胞中NF-κBp65核轉(zhuǎn)位和核內(nèi)蛋白含量的影響。用25mmol/L的高糖培養(yǎng)液孵育SRA01/04細(xì)胞,按照不同作用時(shí)間分為9組:0、5、10、15、20、25、30、35、40min組。
　　 2.2探討不同濃度葡萄糖對(duì)SRA01/04細(xì)胞中NF-κBp65核轉(zhuǎn)位、核內(nèi)蛋白含量及其硝基化水平的影響。實(shí)驗(yàn)分為5組:5.5、10、15、20、25、30mmol/L組。作用時(shí)間為20min。
　

9、　 2.3探討ONOO-對(duì)SRA01/04細(xì)胞中NF-κBp65核轉(zhuǎn)位、核內(nèi)蛋白含量及其硝基化水平的影響。用SIN-1作為ONOO-供體,按照不同濃度分為6組:0、10、50、100、250、500μmol/L組。作用時(shí)間為20min。
　　 2.4探討高糖(25mmol/L)狀態(tài)下,清除ONOO-后對(duì)SRA01/04細(xì)胞中NF-κBp65核轉(zhuǎn)位、核內(nèi)蛋白含量及其硝基化水平的影響。用25mmol/L的高糖培養(yǎng)基孵育SRA01/

10、04細(xì)胞,用FeTPPS作為ONOO-的分解催化劑,按照FeTPPS的不同濃度分為6組:0、5、10、25、50、100μmol/L組。作用時(shí)間為20min。
　　 3 NF-κBp65核轉(zhuǎn)位的形態(tài)學(xué)觀察。
　　 免疫熒光染色法觀察SRA01/04細(xì)胞中NF-κBp65亞基是否轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核內(nèi)從而確認(rèn)NF-κB是否被活化。
　　 4細(xì)胞核內(nèi)NF-κBp65的蛋白含量及其硝基化水平的檢測(cè)。
　　 提取各組核蛋