環(huán)孢霉素A對人晶狀體上皮細胞抑制的體外研究.pdf

1、目的：
　　 體外研究環(huán)孢霉素A(CsA)對人晶狀體上皮細胞(HLEB-3)抑制，計算CsA對人晶狀體上皮細胞的半數有效抑制濃度;定量測定PCNA基因在無CsA處理的對照組與CsA處理的實驗組中的表達，進一步探討CsA抑制人晶狀體上皮細胞增殖的分子作用機制，驗證CsA與PCNA陽性細胞表達量的關系，為CsA修飾的IOL體內實驗提供依據。
　　 方法：
　　 體外培養(yǎng)來源于廣州中山醫(yī)科大學眼科中心的人晶狀體上皮細胞

2、株HLE B-3細胞。
　　 (1)細胞增殖實驗的測定觀察細胞增殖狀態(tài)，實驗設置10個細胞濃度梯度（0.125×104個/ml、0.25×104個/ml、0.5×104個/ml、1.0×104個/ml、1.5×104個/ml、2.0×104個/ml、2.5×104個/ml、3.0×104個/ml、3.5×104個/ml、4.0×104個/ml）。以2×104個/ml細胞密度種植96孔板，設置實驗組與對照組，實驗組給予CsA刺激，

3、濃度為1ug/ml、2ug/ml、4ug/ml、8ug/ml、16ug/ml，作用時間24h、48h、72h，對照組無CsA刺激，作用時間24h、48h、72h。每組設2個平行復孔，重復3次。
　　 (2)PCNA基因的表達測定以1×105個/ml的細胞密度接種于24孔板，實驗組給予CsA刺激，濃度1ug/ml，作用24h、48h，對照組無CsA刺激，應用RT-PCR檢測PCNA基因的復制;應用組織免疫學方法檢測PCNA陽性細胞

4、的表達。每組設2個平行復孔，重復3次。
　　 (3)RT-PCR結果應用2-ΔΔCT統計量進行分析，免疫組織化學結果分別應用PI及IPP.5.0圖像分析法。所有統計學數據，應用SPSS19.0進行統計學分析，檢驗水準a=0.05。
　　 結果：
　　 (1)在低濃度時(1ug/ml) CsA作用24h對人晶狀體上皮細胞的增殖抑制實驗組與對照組差異不具有統計學意義(P＞0.05)，作用48h對細胞增殖抑制實驗組與對

5、照組差異具有統計學意義(P＜0.05)。CsA作用24h，IC50=71.010±1.851μg/ml，Probit=-2.964+1.601x; CsA作用48h, IC50=25.529±1.407μg/ml,Probit=-1.363+1.969x; CsA作用72h, IC50=17.881±1.252μg/ml,Probit=-5.915+4.723x。CsA對HLEB-3細胞的抑制呈時間依賴性及濃度依賴性。
　　 (

6、2)RT-PCR測定，CsA1ug/ml作用24h PCNA表達量實驗組與對照組差異不具有統計學意義(P＞0.05)，作用48h PCNA表達量實驗組與對照組差異具有統計學意義（P＜0.05）。
　　 (3)免疫組織化學測定，CsA1ug/ml作用24h、48h PCNA陽性細胞在實驗組與對照組中，作用24h差異不具有統計學意義(P＞0.05);作用48h差異具有統計學意義（P＜0.05）。
　　 結論：
　　

7、(1)CsA1ug/ml作用24h，不能對HLE-B3增殖的抑制產生有效作用;在持續(xù)作用至48h時，CsA能夠有效抑制HLEB-3細胞的增殖。CsA對HLEB-3細胞抑制呈時間依賴性;在有效抑制濃度(1ug/ml)下，CsA對HLEB-3的抑制呈濃度依賴性，其半數抑制率提高。
　　 (2)CsA能夠抑制PCNA基因的表達，且呈時間依賴性。環(huán)孢霉素A能夠抑制PCNA蛋白的表達，且呈時間依賴性。
　　 (3)CsA通過抑制抑