miRNA調(diào)控晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　為進(jìn)一步探討年齡相關(guān)性白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制，本研究采用miRNA芯片技術(shù)篩選人眼年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞與正常晶狀體上皮細(xì)胞中miRNA的表達(dá)譜，并對hsa-miRNA-15a調(diào)控晶狀體上皮細(xì)胞凋亡機(jī)制進(jìn)行熒光定量分析及細(xì)胞培養(yǎng)過表達(dá)檢測，進(jìn)一步闡明年齡相關(guān)性白內(nèi)障與晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的關(guān)系，為白內(nèi)障的基因治療奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1、miRNA芯片篩選miRNA在年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞及正

2、常晶狀體上皮細(xì)胞中的表達(dá)譜，初步篩選出與年齡相關(guān)性白內(nèi)障發(fā)生相關(guān)的miRNAs表達(dá)譜，為miRNAs參與晶狀體上皮細(xì)胞凋亡行為的機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。
　　本研究采用miRNAs芯片技術(shù)，選取5例年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體前囊膜及5例正常晶狀體前囊膜，檢測兩種晶狀體上皮細(xì)胞內(nèi)miRNAs的表達(dá)，篩選出與白內(nèi)障發(fā)生相關(guān)且差異大于2倍的miRNAs。
　　2、檢測hsa-miRNA-15a及其靶基因bcl-2、mcl-1在年齡相關(guān)性白內(nèi)

3、障晶狀體上皮細(xì)胞及正常晶狀體上皮細(xì)胞中的表達(dá)，研究hsa-miRNA-15a及其靶基因bcl-2、mcl-1在年齡相關(guān)性白內(nèi)障發(fā)生過程中的變化，進(jìn)一步闡明其在白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　本研究選取60例年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者，包括皮質(zhì)性白內(nèi)障20例、核性白內(nèi)障20例和后囊下型白內(nèi)障20例（分別標(biāo)記為A、B、C組），20例正常晶狀體前囊膜上皮細(xì)胞做為對照組，采用實(shí)時熒光定量PCR（Real-time PCR）方法檢測hsa-miRN

4、A-15a-5p、hsa-miRNA-15a-3p在對照組和三種不同類型年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞中的表達(dá);同上述方法，將獲取的晶狀體前囊膜一半用于Real-time PCR，另一半用于Western blot檢測，分別采用這兩種方法檢測其靶基因bcl-2和mcl-1在對照組和三種不同類型年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞中的表達(dá)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　3、培養(yǎng)人品狀體上皮細(xì)胞，將hsa-miRNA-15a過表達(dá)于人晶狀體上皮細(xì)

5、胞，檢測hsa-miRNA-15a對晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的影響，從而進(jìn)一步明確其對細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的作用。
　　選取人晶狀體上皮細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，分別轉(zhuǎn)染hsa-miRNA-15a-5p和hsa-miRNA-15a-3p，采取Real-time PCR驗(yàn)證其在培養(yǎng)人細(xì)胞中的表達(dá)量，電鏡觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，通過MTS、平板克隆細(xì)胞增殖試驗(yàn)，Hoechst、TUNEL、AnnexinⅤ-FTTC/PI凋亡檢測及細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwel

6、l侵襲遷移實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞功能學(xué)的改變。
　　結(jié)果：
　　1.通過對年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞和正常晶狀體細(xì)胞樣品miRNAs芯片表達(dá)譜的結(jié)果分析，以上調(diào)或下調(diào)＞2倍為基準(zhǔn)，通過篩選，其中有181個miRNAs上調(diào)，有114個miRNAs下調(diào)。在這些miRNAs中，有126個上調(diào)超過5倍;有51個下調(diào)超過5倍。
　　2.通過Real-time PCR檢測結(jié)果顯示:hsa-miRNA-15a-5p、hsa-miRNA-1

7、5a-3p、在正常晶狀體上皮細(xì)胞中有少量表達(dá)，而在皮質(zhì)性、核性及后囊下型白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞表達(dá)量明顯增高，在皮質(zhì)性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞中表達(dá)水平可達(dá)正常晶狀體的5-8倍，在核型白內(nèi)障中達(dá)到10倍以上，在后囊下型白內(nèi)障中甚至可達(dá)20倍以上。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，hsa-miRNA-15a-5p在皮質(zhì)性白內(nèi)障組、核性白內(nèi)障組、后囊下型白內(nèi)障組中平均相對表達(dá)量與對照組比較差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01）;hsa-miRNA-15a-3p

8、在皮質(zhì)性白內(nèi)障組、核性白內(nèi)障組、后囊下型白內(nèi)障組中平均相對表達(dá)量與對照組比較差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。Real-time PCR和Western-blot檢測結(jié)果均顯示:bcl-2和mcl-1在正常晶狀體上皮細(xì)胞中可見表達(dá)，而在皮質(zhì)性、核性及后囊下型白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞中表達(dá)量明顯下調(diào)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，bcl-2在皮質(zhì)性白內(nèi)障組、核性白內(nèi)障組、后囊下型白內(nèi)障組中平均相對表達(dá)量與對照組比較差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01

9、）;mcl-1在在皮質(zhì)性白內(nèi)障組、核性白內(nèi)障組、后囊下型白內(nèi)障組中平均相對表達(dá)量與對照組比較差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　3.采用經(jīng)典的Taqman探針方法，對轉(zhuǎn)染了hsa-miRNA-15a-5p、hsa-miRNA-15 a-3p的人晶狀體上皮細(xì)胞(Human Lens Epithelial，HLE-B3)進(jìn)行了定量分析。結(jié)果顯示在HLE-B3細(xì)胞中未檢測到hsa-miRNA-15a-5p或hsa-miRNA-

10、15a-3p，可能極低甚至不表達(dá)這兩種miRNA;轉(zhuǎn)染了hsa-miRNA-15a-5p和hsa-miRNA-15a-3p的HLE-B3細(xì)胞中，這兩種miRNA表達(dá)均有顯著提高。細(xì)胞形態(tài)顯示轉(zhuǎn)染了這兩種miRNA的細(xì)胞，從24h就開始發(fā)生改變，細(xì)胞變大變圓，輪廓不清，交織的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)減少。MTS結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了這兩種miRNA之后，其生長明顯受到抑制。hsa-miRNA-15a-3p對HLE-B3生長的最大抑制率達(dá)到57.13％，hsa-m

11、iRNA-15 a-5p對HLE-B3生長的最大抑制率達(dá)到44.60％。平板克隆結(jié)果顯示hsa-miRNA-15a-5p和hsa-miRNA-15 a-3p對HLE-B3細(xì)胞的克隆形成能力也有明顯的抑制作用，TUNEL凋亡檢測結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染了這兩種miRNA的HLE-B3細(xì)胞檢測到明顯的綠色熒光，說明這兩種miRNA誘發(fā)了HLE-B3細(xì)胞的凋亡。AnnexinⅤ-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測顯示轉(zhuǎn)染后的HLE-B3細(xì)胞，其細(xì)胞碎片明顯

12、多于對照組;劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了hsa-miRNA-15a-5p的HLE-B3細(xì)胞的水平遷移能力受到明顯抑制，而轉(zhuǎn)染hsa-miRNA-15a-3p的細(xì)胞沒有影響。
　　結(jié)論：
　　1.年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞中miRNAs表達(dá)譜與正常晶狀體上皮細(xì)胞表達(dá)譜有差異，差異表達(dá)的miRNAs可能參與了年齡相關(guān)性白內(nèi)障的發(fā)生。
　　2 hsa-miRNA-15a-5p和hsa-miRNA-15a-3p在三種不同類型的年

13、齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞中表達(dá)均較正常晶狀體上皮細(xì)胞表達(dá)升高;而bcl-2和mcl-1均較正常晶狀體上皮細(xì)胞表達(dá)降低。hsa-miRNA-15 a-5p、hsa-miRNA-15a-3p可能通過抑制其靶基因bcl-2和mcl-1的表達(dá)促使細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致年齡相關(guān)性白內(nèi)障發(fā)生。
　　3.hsa-miRNA-15a-5p和hsa-miRNA-15a-3p轉(zhuǎn)染人晶狀體上皮細(xì)胞后抑制細(xì)胞增殖及克隆，促使晶狀體上皮細(xì)胞發(fā)生調(diào)亡，從而啟動了