小窩蛋白-1在高糖誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡調(diào)控中的作用.pdf

1、目的：小窩蛋白-1(caveolin-1)參與了上皮細(xì)胞(epithelium)凋亡的調(diào)控過(guò)程，而既往的研究證實(shí)晶狀體上皮細(xì)胞(lens epithelial cells，LECs)凋亡在早期的糖尿病性白內(nèi)障發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。本研究的第一部分，通過(guò)高糖干預(yù)LECs，觀察細(xì)胞的凋亡率變化和小窩(caveolae)的分布，Caveolin-1的mRNA水平及蛋白表達(dá)變化情況，探討Caveolin-1與高濃度葡萄糖干預(yù)的LECs凋亡之

2、間的關(guān)系，以明確Caveolin-1在高糖誘導(dǎo)的LECs凋亡調(diào)控中發(fā)揮的作用。本研究第二部分，通過(guò)研究表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor， EGF)和辛伐他汀(simvastatin)對(duì)高糖干預(yù)的LECs的細(xì)胞凋亡率和Caveolin-1表達(dá)的影響，進(jìn)一步闡明Caveolin-1與高糖干預(yù)的LECs凋亡之間的相關(guān)性，為將來(lái)研究Caveolin-1與糖尿病性白內(nèi)障之間的關(guān)系，以及糖尿病性白內(nèi)障的防治奠定基礎(chǔ)。

3、r>　　 方法：根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的LECs高糖干預(yù)模型，將葡萄糖溶液(5-25 mM)，或?qū)⒆鳛闈B透壓對(duì)照的甘露醇(20mM)和葡萄糖(5 mM)的混合溶液加入DMEM培養(yǎng)液，并用該培養(yǎng)液處理人晶狀體上皮細(xì)胞(human lens epithelial cells，HLECs)的B3系細(xì)胞株。收集經(jīng)過(guò)1-48h培養(yǎng)的細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率、實(shí)時(shí)定量RT-PCR測(cè)定Caveolin-1的mRNA表達(dá)、Westem blot法分析

4、Caveolin-1蛋白水平、免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法觀察Caveolin-1和磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)的表達(dá)、透射電鏡觀察Caveolae的分布。此外，進(jìn)一步將EGF(0.1 ng/ml)或辛伐他汀(10 nM)和葡萄糖(5或25mM)一起加入DMEM培養(yǎng)液，處理細(xì)胞48h，同樣使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，并用實(shí)時(shí)定量RT-PCR和Westem blot法評(píng)價(jià)Caveolin-1的表達(dá)水平。
　　

5、 結(jié)果：
　　 1.不同濃度的葡萄糖干預(yù)，對(duì)HLECs凋亡率及Caveolin-1的mRNA表達(dá)的影響。
　　 經(jīng)過(guò)5、10、15、20、25mM葡萄糖培養(yǎng)液的48h培養(yǎng)，HLECs的凋亡率隨糖的干預(yù)濃度增加而明顯增加(p<0.05)，而Caveolin-1的mRNA表達(dá)水平則明顯減少(p<0.01)。其中，25mM葡萄糖干預(yù)組HLECs的凋亡率最高，Caveolin-l的mRNA表達(dá)水平最低。滲透壓對(duì)照組的HLECs凋

6、亡率、Caveolin-1的mRNA表達(dá)水平與5mM葡萄糖干預(yù)組無(wú)顯著差異(p>0.05)。
　　 2.不同時(shí)間的高糖干預(yù)，對(duì)HLECs凋亡率及Caveolin-1的mRNA表達(dá)的影響。
　　 進(jìn)一步對(duì)高糖(25mM葡萄糖)干預(yù)下，HLECs的凋亡率和Caveolin-l的mRNA表達(dá)水平與干預(yù)時(shí)間的相關(guān)性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)1-48h培養(yǎng)，對(duì)照組HLECs的凋亡率及Caveolin-1的mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯增加(p>0

7、.05)，而從12h開始，高糖干預(yù)組的HLECs的凋亡率隨培養(yǎng)時(shí)間增加而明顯增加(p<0.05)，Caveolin-1的mRNA表達(dá)水平則明顯下降(P<0.05)。
　　 3.高糖對(duì)HLECs的Caveolin-I蛋白表達(dá)的影響。
　　 此外，與我們檢測(cè)到的Caveolin-1的mRNA表達(dá)的變化趨勢(shì)類似，Westem blot的結(jié)果顯示，經(jīng)48h的培養(yǎng)，HLECs的Caveolin-I蛋白表達(dá)隨干預(yù)的糖濃度增加而明顯減

8、少(P<0.05)，滲透壓對(duì)照組則與5mM對(duì)照組蛋白表達(dá)相近(p>0.05)。而在高糖干預(yù)1-48h的時(shí)間相關(guān)性實(shí)驗(yàn)中，從24h開始，高糖干預(yù)組的HLECs隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，Caveolin-1蛋白表達(dá)也逐漸減少(P<0.05)。
　　 4.免疫熒光染色和透射電鏡觀察。
　　 在免疫熒光細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組細(xì)胞相比，高糖干預(yù)組的Caveolin-1熒光染色強(qiáng)度明顯下降，說(shuō)明Caveolin-1蛋白表達(dá)下降。另外，從

9、細(xì)胞膜的胞漿側(cè)外翻到細(xì)胞膜外側(cè)的PS染色陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)明顯增加，說(shuō)明細(xì)胞的凋亡率增加。透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，高糖干預(yù)使HLECs的Caveolae分布明顯減少。
　　 5.辛伐他汀和EGF對(duì)高糖干預(yù)HLECs凋亡率及Caveolin-1表達(dá)的影響。
　　 辛伐他汀和EGF可以明顯增加高糖干預(yù)組的Caveolin-1 mRNA的水平(p<0.01)，同時(shí)使HLECs凋亡率明顯降低(p<0.05)。辛伐他汀和EGF都可以使，

10、高糖培養(yǎng)HLECs的Caveolin-1蛋白表達(dá)水平，明顯增高到接近SmM葡萄糖對(duì)照組的水平。
　　 結(jié)論：
　　 1.本研究首次聯(lián)合應(yīng)用實(shí)時(shí)定量RT-PCR法、Westem-blot法、免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法和透射電鏡法，對(duì)高糖培養(yǎng)的HLECs進(jìn)行Caveolin-1表達(dá)和Caveolae的分布的分析，發(fā)現(xiàn)HLECs的Caveolin-1表達(dá)和Caveolae的分布明顯受到環(huán)境中糖濃度的影響，高濃度的葡萄糖使Caveoli

11、n-1表達(dá)降低，Caveolae分布減少。研究結(jié)果提示，HLECs的Caveolin-1結(jié)構(gòu)，參與了細(xì)胞對(duì)高糖刺激的反應(yīng)過(guò)程。
　　 2.本研究首次將Caveolin-1蛋白，引入了對(duì)高糖誘導(dǎo)的HLECs凋亡實(shí)驗(yàn)研究中，并發(fā)現(xiàn)高糖干預(yù)使HLECs的Caveolin-I表達(dá)下降，而細(xì)胞凋亡增加，兩者存在相關(guān)性。這就明確了，Caveolin-1在高糖誘導(dǎo)HLECs凋亡過(guò)程中發(fā)揮作用，并可能參與凋亡的調(diào)控過(guò)程。這還為將來(lái)，進(jìn)一步根據(jù)糖

12、尿病引起的LECs凋亡可以導(dǎo)致糖尿病性白內(nèi)障的既往研究結(jié)果，深入研究Caveolin-1與糖尿病性白內(nèi)障形成的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。
　　 3.本研究使用臨床上常見的辛伐他汀和EGF兩種藥物干預(yù)高糖培養(yǎng)的HLECs，發(fā)現(xiàn)兩者都使HLECs的Caveolin-1表達(dá)增加，而細(xì)胞凋亡率減少，并且細(xì)胞Caveolin-1表達(dá)和凋亡率都恢復(fù)到接近正常組的水平。說(shuō)明HLECs在高糖干預(yù)情況下，Caveolin-1表達(dá)的變化與的LECs凋亡存在相關(guān)