霍山石斛多糖及其酶解片段抑制H2O2誘導(dǎo)人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、霍山石斛為蘭科多年生草本植物,是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴中草藥。多糖是霍山石斛的主要活性成分之一,具有抗腫瘤、抗氧化、抗白內(nèi)障和免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性。我們的前期研究發(fā)現(xiàn),霍山石斛多糖具有較強(qiáng)的抗白內(nèi)障活性。由于晶狀體上皮細(xì)胞凋亡是白內(nèi)障發(fā)生的主要病理機(jī)制之一,所以本課題以此為切入點(diǎn),采用酶解分子修飾方法,對(duì)霍山石斛多糖抑制晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的分子調(diào)控機(jī)制及其構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行了研究,主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　(1)霍山石斛多糖的分離純化和酶法修飾

2、:霍山石斛類(lèi)原球莖經(jīng)水提醇沉獲得總多糖,再利用DEAE-Cellulose陰離子交換層色譜以及膜分離技術(shù)(截留分子量8000Da和3500Da)對(duì)其進(jìn)行分離純化,獲得多糖均一組分DHPD1。酶篩選研究發(fā)現(xiàn),果膠酶較適合DHPD1的酶解修飾。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)、響應(yīng)面分析獲得果膠酶降解修飾的最優(yōu)條件為:酶濃度126 U/mL,反應(yīng)pH4.46,反應(yīng)溫度48℃。在此優(yōu)化條件下,以DHPD1為起始分子,通過(guò)改變反應(yīng)時(shí)間(1h,8h,24h),獲得

3、了三種酶解片段DHPD1-1H、DHPD1-8H和DHPD1-24H,分子量分別為2535Da、1997Da和1552Da。
　　(2)DHPD1酶解片段的結(jié)構(gòu)表征:單糖組成分析表明, DHPD1-1H、DHPD1-8H和DHPD1-24H均由Ara、Xyl、Man、Glc和Gal五種單糖構(gòu)成,摩爾比分別為0.037:0.014:0.064:1.272:0.041、0.033:0.022:0.086:0.882:0.094和0.1

4、84:0.171:0.293:1.023:0.069。甲基化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),DHPD1-1H、DHPD1-8H和DHPD1-24H均包含1-Glcp、1,4-Glcp、1,4,6-Glcp、1,3,6-Manp、1,5-Araf、1,6-Glcp、1,6-Galp和1-Xylp八種糖苷鍵連接方式,組成摩爾比分別為1.89:6.87:0.79:0.49:0.25:0.83:0.42:0.09、2.04:5.59:1.37:1.01:0.35:1

5、.29:1.03:0.31和2.11:2.04:0.91:1.53:1.06:0.93:0.36:1.01。依據(jù)DHPD1的基本結(jié)構(gòu)特征,采用NMR技術(shù)對(duì)這三種酶解片段的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn), DHPD1-24H是DHPD1、DHPD1-1H和DHPD1-8H的共同核心結(jié)構(gòu)。
　　(3)DHPD1及其酶解片段抑制人晶狀體上皮(HLE細(xì)胞)凋亡活性及其分子調(diào)控機(jī)制:MTT實(shí)驗(yàn)和AnnexinV-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)分析可

6、知DHPD1及其酶解片段能夠顯著抑制H2O2誘導(dǎo)HLE細(xì)胞的損傷和凋亡。熒光定量RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與正常對(duì)照組相比,H2O2不僅抑制了HLE細(xì)胞Bcl-2基因的表達(dá),而且上調(diào)了Bax、Caspase-3、Caspase-9、IL-1β和TGF-β2的基因表達(dá)。與模型組相比,多糖處理組不僅上調(diào)了HLE細(xì)胞Bcl-2基因的表達(dá),而且抑制了Bax、Caspase-3、Caspase-9、IL-1β和TGF-β2的基因表達(dá)。Western

7、Blot分析發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,模型組p-Akt、p-JNK、p-P38和p-ERK1/2的蛋白表達(dá)量明顯提高,表明H2O2激活了PI3K/Akt和MAPK信號(hào)通路;與模型組相比,DHPD1及其酶解片段顯著抑制了H2O2對(duì)PI3K/Akt和MAPK信號(hào)通路的活化效應(yīng)。
　　綜上所述,霍山石斛多糖抑制HLE細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制可能是多糖通過(guò)對(duì)H2O2活化MAPK和PI3K/Akt等信號(hào)通路的干預(yù)作用,調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax、Caspa