霍山石斛多糖及其酶解片段抑制H2O2誘導人晶狀體上皮細胞凋亡的研究.pdf

1、霍山石斛為蘭科多年生草本植物,是我國傳統(tǒng)的名貴中草藥。多糖是霍山石斛的主要活性成分之一,具有抗腫瘤、抗氧化、抗白內(nèi)障和免疫調節(jié)等多種生物活性。我們的前期研究發(fā)現(xiàn),霍山石斛多糖具有較強的抗白內(nèi)障活性。由于晶狀體上皮細胞凋亡是白內(nèi)障發(fā)生的主要病理機制之一,所以本課題以此為切入點,采用酶解分子修飾方法,對霍山石斛多糖抑制晶狀體上皮細胞凋亡的分子調控機制及其構效關系進行了研究,主要實驗結果如下:
　　(1)霍山石斛多糖的分離純化和酶法修飾

2、:霍山石斛類原球莖經(jīng)水提醇沉獲得總多糖,再利用DEAE-Cellulose陰離子交換層色譜以及膜分離技術(截留分子量8000Da和3500Da)對其進行分離純化,獲得多糖均一組分DHPD1。酶篩選研究發(fā)現(xiàn),果膠酶較適合DHPD1的酶解修飾。通過單因素實驗、響應面分析獲得果膠酶降解修飾的最優(yōu)條件為:酶濃度126 U/mL,反應pH4.46,反應溫度48℃。在此優(yōu)化條件下,以DHPD1為起始分子,通過改變反應時間(1h,8h,24h),獲得

3、了三種酶解片段DHPD1-1H、DHPD1-8H和DHPD1-24H,分子量分別為2535Da、1997Da和1552Da。
　　(2)DHPD1酶解片段的結構表征:單糖組成分析表明, DHPD1-1H、DHPD1-8H和DHPD1-24H均由Ara、Xyl、Man、Glc和Gal五種單糖構成,摩爾比分別為0.037:0.014:0.064:1.272:0.041、0.033:0.022:0.086:0.882:0.094和0.1

4、84:0.171:0.293:1.023:0.069。甲基化實驗發(fā)現(xiàn),DHPD1-1H、DHPD1-8H和DHPD1-24H均包含1-Glcp、1,4-Glcp、1,4,6-Glcp、1,3,6-Manp、1,5-Araf、1,6-Glcp、1,6-Galp和1-Xylp八種糖苷鍵連接方式,組成摩爾比分別為1.89:6.87:0.79:0.49:0.25:0.83:0.42:0.09、2.04:5.59:1.37:1.01:0.35:1

5、.29:1.03:0.31和2.11:2.04:0.91:1.53:1.06:0.93:0.36:1.01。依據(jù)DHPD1的基本結構特征,采用NMR技術對這三種酶解片段的化學結構進行了鑒定,結果發(fā)現(xiàn), DHPD1-24H是DHPD1、DHPD1-1H和DHPD1-8H的共同核心結構。
　　(3)DHPD1及其酶解片段抑制人晶狀體上皮(HLE細胞)凋亡活性及其分子調控機制:MTT實驗和AnnexinV-FITC/PI流式細胞術分析可

6、知DHPD1及其酶解片段能夠顯著抑制H2O2誘導HLE細胞的損傷和凋亡。熒光定量RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),與正常對照組相比,H2O2不僅抑制了HLE細胞Bcl-2基因的表達,而且上調了Bax、Caspase-3、Caspase-9、IL-1β和TGF-β2的基因表達。與模型組相比,多糖處理組不僅上調了HLE細胞Bcl-2基因的表達,而且抑制了Bax、Caspase-3、Caspase-9、IL-1β和TGF-β2的基因表達。Western

7、Blot分析發(fā)現(xiàn),與對照組相比,模型組p-Akt、p-JNK、p-P38和p-ERK1/2的蛋白表達量明顯提高,表明H2O2激活了PI3K/Akt和MAPK信號通路;與模型組相比,DHPD1及其酶解片段顯著抑制了H2O2對PI3K/Akt和MAPK信號通路的活化效應。
　　綜上所述,霍山石斛多糖抑制HLE細胞凋亡的作用機制可能是多糖通過對H2O2活化MAPK和PI3K/Akt等信號通路的干預作用,調節(jié)Bcl-2、Bax、Caspa