細(xì)胞外Ca2+濃度的變化對人晶狀體上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激影響的研究.pdf

1、目的：本研究擬用改變細(xì)胞外Ca2+濃度的方法，探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ehdoplasmic reticulum stress，ERS）及其介導(dǎo)的凋亡在白內(nèi)障中的可能發(fā)病機(jī)制。
　　方法：1.采用不同濃度鈣培養(yǎng)液（正常培養(yǎng)液、增加鈣濃度1.0、5.0、7.5、10.0、15.0、20.0、25.0mmol/L培養(yǎng)液）培養(yǎng)人LECs24h。采用Flou-3鈣熒光探針負(fù)載后應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度的變化。
　　2.應(yīng)用免

2、疫熒光（IF）技術(shù)及蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測細(xì)胞外Ca2+濃度變化對calpain-2表達(dá)的影響。
　　3. Western Blot方法測細(xì)胞外Ca2+濃度變化對GRP78、caspase-12表達(dá)的影響。
　　4.采用DAPI染色法觀察細(xì)胞核的形態(tài)學(xué)變化，分析細(xì)胞外Ca2+濃度變化對細(xì)胞凋亡率的影響。
　　結(jié)果：1.流式細(xì)胞術(shù)示鈣處理組細(xì)胞內(nèi)Ca2+平均熒光強(qiáng)度值增高。隨著培養(yǎng)液Ca2+濃度增

3、加，與對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　2.免疫熒光及Western blot顯示，隨著培養(yǎng)液Ca2+濃度升高，calpain-2表達(dá)逐步增高，與對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　3. Western Blot結(jié)果顯示，GRP78、caspase-12蛋白的表達(dá)較未處理組逐漸升高，與對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　4. DAPI顯示鈣處理組細(xì)胞隨著培養(yǎng)液Ca2+濃

4、度升高，細(xì)胞核表現(xiàn)出典型的凋亡形態(tài)學(xué)特征的細(xì)胞數(shù)增多。培養(yǎng)液增加鈣濃度為1.0mmol/L時(shí)，細(xì)胞凋亡率無明顯變化，與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；培養(yǎng)液增加鈣濃度為5.0mmol/L，凋亡率增高，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；隨著培養(yǎng)液Ca2+濃度進(jìn)一步增高，凋亡率升高，各組與對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　5.鈣處理組細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+增高的程度與GRP78的表達(dá)呈正相關(guān)r=0

5、.952，P<0.05；凋亡率與calpain-2及caspase-12的表達(dá)呈正相關(guān)，r值分別為0.912，0.940，P值都小于0.01。
　　結(jié)論：1.體外培養(yǎng)的人LECs外Ca2+濃度升高，細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+增多，calpain-2表達(dá)增高。
　　2.體外培養(yǎng)的人LECs外Ca2+濃度輕度升高，激活了calpain-2以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，但是尚未對細(xì)胞的凋亡產(chǎn)生影響；細(xì)胞外Ca2+濃度異常增高，細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激無法適應(yīng)，細(xì)