手機微波輻射對人晶狀體上皮細胞影響的蛋白質(zhì)組學研究.pdf

1、白內(nèi)障是人類嚴重的致盲眼病之一，在我國已列為致盲性眼病的首位。先天遺傳、年齡、青光眼、葡萄膜炎、代謝性疾病、藥物中毒和眼外傷等等是最常見的發(fā)病因素。近來，一個曾經(jīng)被忽視的影響因素愈來愈受到人們的重視，那就是各種電磁波輻射。目前，電磁波中微波對晶狀體造成損傷的機制，以及引發(fā)白內(nèi)障的病理過程是研究和討論的重點之一，也是爭論的焦點。近些年的研究發(fā)現(xiàn)，強度高于10mW/cm2的微波輻射就足以引起晶狀體內(nèi)部水溶性蛋白質(zhì)比率的改變。 蛋白質(zhì)

2、組學(Proteomics)是后基因組時代生命科學研究的熱點領域。它是以蛋白質(zhì)組為研究對象，分析細胞內(nèi)動態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成份、表達水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，在整體水平上研究蛋白質(zhì)的組成與調(diào)控的活動規(guī)律。目前蛋白質(zhì)組學技術已被廣泛地應用到生命科學的基礎學科中，但對人體某一特定細胞或組織進行蛋白質(zhì)組學研究的報道仍然很少。如果能從人類晶狀體上皮細胞的蛋白質(zhì)組中篩選出與白內(nèi)障發(fā)生密切相關的標志性蛋白，將對白內(nèi)障的機理性研

3、究產(chǎn)生突破性的推動作用。 本研究首先對傳統(tǒng)的雙向電泳方法進行了優(yōu)化，以雙向凝膠電泳結合質(zhì)譜分析的方法，對人晶狀體上皮細胞蛋白質(zhì)組譜的表達進行探索，以期建立人晶狀體疾病蛋白質(zhì)組學的研究途徑。 在接下來的研究中，我們運用建立起的蛋白質(zhì)組學實驗平臺，分析1.8GMHz微波輻射對體外培養(yǎng)的人類晶狀體上皮細胞的影響。 第一部份人晶狀體上皮細胞蛋白質(zhì)組學實驗體系的建立 [目的]建立人晶狀體上皮細胞蛋白質(zhì)組學研究體系，

4、探討雙向電泳和質(zhì)譜鑒定技在人晶狀體上皮細胞蛋白質(zhì)組學研究中的作用。 [方法]體外培養(yǎng)人晶狀體上皮細胞株，用兩種不同方法提取總蛋白，進行固相pH梯度(IPG)等電聚焦雙向凝膠電泳，銀染顯色的凝膠通過GS-800掃描儀(Bio-Rad)獲取圖像，使用PDQuest專業(yè)圖像分析軟件分析電泳圖像，尋找并分析差異蛋白質(zhì)斑點。在此基礎之上，采用自動凝膠采樣系統(tǒng)采集蛋白質(zhì)斑點，然后用特異性的胰酶消化蛋白質(zhì)，酶解后的肽段采用LCQDecaXP型

5、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進行質(zhì)譜分析。 [結果]獲得了重復性較好的人晶狀體上皮細胞蛋白質(zhì)組電泳圖譜。晶狀體蛋白質(zhì)斑點在等電點PH值為4～7、相對分子質(zhì)量為17kD～72kD之間均有分布。其中高豐度蛋白質(zhì)斑點主要分布于分子量19kD～50kD、PI5～7范圍內(nèi)。2個蛋白質(zhì)斑點通過質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫的檢索得到了初步的鑒定。 [結論]建立起了一個穩(wěn)定的分析人晶狀體上皮細胞蛋白質(zhì)組學實驗體系；為進一步研究人類晶狀體在生理狀態(tài)及白內(nèi)

6、障等病理狀態(tài)下的改變提供了蛋白質(zhì)組學的研究方法和途徑。 第二部分用雙向電泳及質(zhì)譜分析方法研究手機微波對晶狀體上皮細胞影響 [目的]用蛋白質(zhì)組學方法研究GSM制式1.8GHz微波輻射對體外培養(yǎng)的人晶狀體上皮細胞的影響。 [方法]體外培養(yǎng)人晶狀體上皮細胞株，隨機分組，分別用SAR值為1.0、2.0和3.5W/kg的1.8GHzGSM制式微波輻照2小時，并設對照組。輻照后立即提取總蛋白，用固相pH梯度(IPG)等電聚焦

7、雙向凝膠電泳進行蛋白質(zhì)分離，銀染顯色的凝膠通過GS-800掃描儀(Bio-Rad)獲取圖像，使用PDQuest專業(yè)圖像分析軟件分析電泳圖像。對差異表達的蛋白質(zhì)斑點用自動凝膠采樣系統(tǒng)采集，然后用特異性的胰酶消化蛋白質(zhì)，酶解后的肽段采用LCQDecaXP型高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進行質(zhì)譜分析。用半定量RT-PCR、westernblot對HSP70進行反饋性驗證。 [結果]比較輻照組及假照組細胞蛋白質(zhì)組表達圖譜，SAR值為1.0未發(fā)

8、現(xiàn)差異點、2.0和3.5W/kg共獲得7個差異表達的蛋白質(zhì)點。5個點經(jīng)質(zhì)譜分析、數(shù)據(jù)庫查詢，獲得初步鑒定。其中蛋白質(zhì)斑點HSP-70和hnRNPK在輻照后的表達是上調(diào)的。RT-PCR及westernblot進一步驗證了雙向凝膠電泳及質(zhì)譜鑒定的結果。 [結論]雙向凝膠電泳結合質(zhì)譜分析是篩選人晶狀體上皮細胞電磁效應異常表達蛋白質(zhì)的有效手段。HSP-70和hnRNPK有可能參與了微波輻照所致人晶狀體上皮細胞非熱效應的應激過程。