內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激對晶狀體上皮細胞凋亡及白內(nèi)障發(fā)病影響的初步研究.pdf

1、背景：
　　白內(nèi)障是引起全球范圍內(nèi)視覺損傷的最主要因素，同時也是我國導致視力下降的主要原因。隨著我國人口平均壽命的延長及人口老齡化趨勢的加劇，白內(nèi)障的發(fā)生不僅使患者的生活質(zhì)量下降，而且也為醫(yī)療保險系統(tǒng)及社會增添了巨大的壓力。而現(xiàn)階段，手術治療是治愈白內(nèi)障的唯一方式。我們迫切需要從白內(nèi)障的發(fā)病機制入手來尋找更廣泛的防治手段。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（(Endoplasmicreticulumstress，ERS）已成為近幾年研究的熱點。有文獻報導

2、在白內(nèi)障的形成中，ERS發(fā)揮著作用。然而仍缺少系統(tǒng)完善的體內(nèi)體外實驗論證。本文將從兩個角度分析在人晶狀體上皮細胞凋亡過程中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激發(fā)生發(fā)展對其的影響。擬更深入的研究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的機制問題，為后續(xù)實驗的進行提供可靠依據(jù)。
　　目的：
　　1.研究ERS是否參與年齡相關性白內(nèi)障和糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)生。
　　2.探討在氧化應激條件下，ERS的激活對人晶狀體上皮細胞(Humanlensepithelialcells，HLEC

3、s)是細胞保護作用還是促凋亡作用。
　　3.探討在ERS發(fā)生的條件下Salubrinal對HLECs的保護作用及其機制。
　　方法：
　　1.采用HE染色和免疫組織化學的方法檢測年齡相關性白內(nèi)障晶狀體前囊膜30例、糖尿病性白內(nèi)障晶狀體前囊膜30例、正常晶狀體30例中GRP78、CHOP、Caspase-12的陽性表達。
　　2.體外培養(yǎng)人晶狀體上皮細胞株HLE-B3于含10％胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基中，以H2

4、O2建立氧化應激模型誘導ERS的發(fā)生。分別在H2O2干預和不干預的情況下，加入不同濃度的Salubrinal(10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L、25μmol/L、30μmol/L、35μmol/L)，應用CCK-8試劑盒篩選適宜的Salubrinal濃度。
　　3．實驗分組為A組(正常對照組)、B組(H2O2200μmol/L組)、C組(H2O2200μmol/L+Salubrinal25μmol/L組)，采用

5、原位缺口末端轉(zhuǎn)移酶標記法和流式細胞儀檢測藥物作用48h后HLE-B3的凋亡情況。
　　4.不同時間點下提取B組蛋白，Westernblotting檢測不同時間點下GRP78、CHOP、Caspase-12、p-eIF2α的變化。
　　5.特定時間點下提取A、B、C組三組蛋白，Westernblotting檢測各組GRP78、CHOP、Caspase-12、p-eIF2α的變化。
　　結(jié)果：
　　1.HE及免疫組化

6、結(jié)果顯示：所有組織染色充分、固定良好、組織結(jié)構(gòu)完整。3種蛋白在NC組中表現(xiàn)為陰性或弱陽性，而在ARC組與DC組中表達均為陽性，ARC組陽性率分別為78%、82%、79%，DC組陽性率分別為83%、75%、81%。
　　2.CCK-8試劑盒結(jié)果顯示，沒有H2O2干預時，不同濃度的Salubrinal對HLE-B3的細胞活性無明顯抑制作用，存活率分別為98.56±3.29%，98.73±2.58%，99.39±3.23%，98.57±

7、1.89%，98.81±2.46%，99.34±3.23%，99.50±2.36%，差異無統(tǒng)計學意義(F=0.087，P=0.997)；應用H2O2干預時，隨著Salubrinal濃度的升高，HLE-B3存活分別為52.86±4.67%，65.01±3.56%，72.89±3.82%，84.45±3.57%，91.64±2.14%，93.12±2.92%，92.02±3.33%，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P值均為0.000)，當S

8、alubrinal濃度大于25μmol/L時，HLE-B3細胞的存活率增加不明顯（#P=0.555、0.878）。
　　3.流式細胞儀檢測3組的細胞凋亡率分別為1.93%±0.70%、8.80%±0.51%、4.29%±0.30%，各組之間差異有統(tǒng)計學意義(F=396.263，P=0.000，與A組比較P值均為0.000)。TUNEL染色結(jié)果分別為A組7.67%±0.99%，B組36.90%±0.95%，C組為16.69%±2.1

9、6%，凋亡指數(shù)差異有統(tǒng)計學意義（F=618.393，P=0.000，與A組比較P值均為0.000）。
　　4.Westernblotting結(jié)果表明：B組中隨著H2O2作用時間的延長，p-eIF2α在6h表達量最高，GRP78在12h表達達峰，CHOP在12h開始升高，持續(xù)至24h，后又逐漸降低，在48h出現(xiàn)最高表達量，Caspase-12在48h表達明顯增加。特定時間點下C組與B組相比，GRP78、CHOP、p-elF2α表達量