Rho-激酶在醛固酮誘導(dǎo)人近端腎小管上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化的機(jī)制研究.pdf

1、目的
　　多關(guān)于醛固酮導(dǎo)致腎臟纖維化相關(guān)方面的研究成果都提示:醛固酮可能作為一個(gè)獨(dú)立的危險(xiǎn)因素直接參與腎臟損害。目前認(rèn)為醛固酮腎損傷是多種途徑共同作用的結(jié)果，其中醛固酮誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelialmesenchymaltransition，EMT)，使腎小管上皮細(xì)胞先轉(zhuǎn)變成為肌成纖維細(xì)胞(myofibroblast，Myof)，再轉(zhuǎn)變成為成纖維細(xì)胞，是促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化是重要的途徑之一。
　　我

2、們先前的研究發(fā)現(xiàn):在醛固酮作用下，小鼠出現(xiàn)大量蛋白尿及腎臟纖維化的同時(shí)伴有Rho激酶活性增強(qiáng)，應(yīng)用Rho激酶抑制劑抑制Rho激酶活性，在不影響血壓的情況下，減輕了醛固酮誘導(dǎo)的腎損傷，說明其有不依賴于降低血壓的腎臟保護(hù)作用。有研究發(fā)現(xiàn)RhoA和它的下游效應(yīng)因子Rho激酶參與體外高糖刺激誘導(dǎo)小鼠腎小管上皮細(xì)胞EMT中的部分過程，進(jìn)而促進(jìn)α-SMA啟動(dòng)子的激活。然而在體外醛固酮誘導(dǎo)的人近端腎小管上皮細(xì)胞EMT過程中，Rho激酶是否介導(dǎo)了這一過

3、程，目前尚無相關(guān)報(bào)道。
　　本次實(shí)驗(yàn)利用體外醛固酮刺激人近端腎小管上皮細(xì)胞，給予醛固酮受體拮抗劑螺內(nèi)酯，Rho激酶抑制劑Y-27632干預(yù)，觀察Rho激酶是否介導(dǎo)了醛固酮誘導(dǎo)體外人近端腎小管上皮細(xì)胞HK2發(fā)生EMT這一過程。
　　方法
　　美國(guó)ATCC細(xì)胞庫，HK2細(xì)胞系為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。
　　將人HK2細(xì)胞分為4組:正常對(duì)照組，醛固酮組，醛固酮+螺內(nèi)酯組，醛固酮+Y-27632組。相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。采用W

4、esternBlot免疫印跡法檢測(cè)上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白E-cadherin，纖維化標(biāo)志蛋白α-SMA，Rho激酶下游底物活性標(biāo)志蛋白MYPT-1表達(dá)。
　　結(jié)果
　　1、細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變:
　　對(duì)照組:HK2細(xì)胞為圓形或橢圓形鋪路石樣形態(tài)。
　　醛固酮組:失去圓形及鋪路石樣形態(tài)，變成了形狀雜亂的長(zhǎng)梭形的成纖維形態(tài)。
　　醛固酮+螺內(nèi)酯組及醛固酮+Y-27632組:HK2細(xì)胞形態(tài)介于對(duì)照組與醛固酮組兩者之間。

5、>　　2、WesternBlot條帶分析顯示:與對(duì)照組相比，醛固酮組HK2上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白E-cadherin表達(dá)明顯減少，纖維化標(biāo)志蛋白α-SMA表達(dá)明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。且E-cadherin和α-SMA的表達(dá)變化對(duì)醛固酮刺激呈濃度及時(shí)間依賴，螺內(nèi)酯和Y-27632可分別減輕這一過程。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，醛固酮組Rho激酶下游標(biāo)記物MYPT-1蛋白表達(dá)明顯增加，螺內(nèi)酯或Y-27632預(yù)孵后的HK2細(xì)胞再給予同樣醛固酮刺激，MYPT-1表