Erbin對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的作用和機(jī)制研究.pdf

1、腎小管-間質(zhì)纖維化是各種慢性腎臟疾病發(fā)展為終末期腎衰竭的共同途徑,而腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(EMT)是腎小管-間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制。在EMT的眾多調(diào)節(jié)因子中,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-beta(TGF-β)被認(rèn)為是最主要的促纖維化因子。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-beta介導(dǎo)的信號(hào)通路非常復(fù)雜,主要包括Smad信號(hào)途徑和非Smad信號(hào)通路(p38MAPK、ERK、JNK、AKT/PKB、RhoA)。本文研究的蛋白分子Erbin是LAP蛋白家族新成員,近期研

2、究發(fā)現(xiàn)Erbin參與了TGF-β誘導(dǎo)EMT各種通路的串話,對(duì)Smad及ERK信號(hào)通路均具有負(fù)性調(diào)節(jié)作用。因此,我們推測(cè)Erbin與腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化之間存在密切關(guān)系,并可能參與腎臟間質(zhì)纖維化的發(fā)生與發(fā)展。在本研究中,我們通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)探討Erbin在腎間質(zhì)纖維化中的表達(dá)變化和其對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的作用及具體機(jī)制。我們的研究結(jié)果表明:無論在大鼠5/6腎切除纖維化動(dòng)物模型還是TGF-β誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化模型中,

3、Erbin表達(dá)均明顯上調(diào)。同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)高表達(dá)Erbin可抑制ERK信號(hào)通路和TGF-β1誘導(dǎo)的EMT進(jìn)程,相反,抑制Erbin的表達(dá)則可增強(qiáng)ERK的磷酸化水平并促進(jìn)TGF-β誘導(dǎo)的EMT進(jìn)程,包括進(jìn)一步抑制E-鈣粘蛋白(E-cadherin)的表達(dá),促進(jìn)α-平滑肌蛋白(α-SMA)的表達(dá)和纖維連接蛋白(Fibronectin, FN)的分泌。然而MEK1/2抑制劑U0126除可抑制ERK的磷酸化之外,還可有效阻斷Erbin對(duì)TGF-β

4、誘導(dǎo)EMT的調(diào)節(jié)作用。此外,我們的研究還發(fā)現(xiàn)在沒有TGF-β刺激時(shí),Erbin并不能調(diào)節(jié)ERK的激活和EMT的進(jìn)程。綜上:我們的研究結(jié)果表明Erbin在腎臟纖維化中反饋性表達(dá)上調(diào),高表達(dá)Erbin可通過阻斷TGF-β/ERK信號(hào)通路抑制TGF-β誘導(dǎo)的EMT進(jìn)程。
　　第一部分 Erbin與腎臟間質(zhì)纖維化之間的關(guān)系研究
　　目的：探討 Erbin在腎臟間質(zhì)纖維化及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 beta1(Transforming growt

5、h factor beta1, TGF-β1)誘導(dǎo)的大鼠近端腎小管上皮細(xì)胞(NRK52E)轉(zhuǎn)分化中表達(dá)量的變化。
　　方法：體內(nèi)實(shí)驗(yàn)采用SD大鼠5/6腎切除法建立腎臟纖維化動(dòng)物模型,收集并檢測(cè)各組血清中Scr,BUN水平,Masson染色觀察腎間質(zhì)纖維化程度,免疫組化及Western blot檢測(cè) Erbin的分布與表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn)采用TGF-β1(10ng/ml)刺激 NRK52E細(xì)胞72h建立上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(EMT)細(xì)胞

6、模型,光學(xué)電子顯微鏡觀察 NRK52E細(xì)胞形態(tài)變化,免疫熒光及Western blot檢測(cè) E-鈣黏蛋白(E-cadherin)和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)蛋白表達(dá)變化,RT-PCR及Western blot檢測(cè)不同 TGF-β1刺激時(shí)間下 Erbin的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：體內(nèi)實(shí)驗(yàn)假手術(shù)組大鼠腎功能正常,Masson染色未見腎間質(zhì)纖維化, Erbin在腎小管表達(dá)較少;模型組中大鼠Scr(140.52±61.11)、BUN(

7、34.23±7.66)明顯高于假手術(shù)組 Scr(33.96±7.28)、BUN(8.11±2.55),腎間質(zhì)可見明顯纖維化, Erbin在腎小管表達(dá)也明顯增加,是假手術(shù)組的2.9倍。體外實(shí)驗(yàn) TGF-β1刺激72h后, NRK52E細(xì)胞形態(tài)向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化,細(xì)胞形態(tài)變大、變梭,細(xì)胞-細(xì)胞間距明顯增大;正常 NRK52E表達(dá) E-cadherin,少量表達(dá) Erbin和α-SMA,而TGF-β1刺激后,NRK52E細(xì)胞 E-cadheri

8、n表達(dá)明顯減少,Erbin和α-SMA表達(dá)則增加,分別是對(duì)照組的2.3倍和2.8倍(P<0.05);同時(shí),TGF-β刺激誘導(dǎo) Erbin表達(dá)具有時(shí)間依賴性,Erbin表達(dá)在 TGF-β刺激24h后開始升高,72h達(dá)到高峰;RT-PCR結(jié)果顯示 TGF-β1刺激72h后,Erbin mRNA水平也明顯升高,是對(duì)照組的1.8倍。
　　結(jié)論：無論腎間質(zhì)纖維化還是 TGF-β1誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中,Erbin表達(dá)均明顯上調(diào),提示 E

9、rbin與腎臟間質(zhì)纖維化之間存在密切關(guān)系。
　　第二部分 Erbin對(duì) TGF-β1誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的作用研究
　　目的：探討 Erbin對(duì) TGF-β誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的作用。
　　方法：用脂質(zhì)體2000將含全長(zhǎng) Erbin基因的質(zhì)?；蚩蛰d體(Prk5-myc-Erbin、Prk5-myc)轉(zhuǎn)染至大鼠近端腎小管上皮細(xì)胞(NRK52E細(xì)胞)48 h,Western blot檢測(cè)正常組、空載體轉(zhuǎn)染組、Er

10、bin轉(zhuǎn)染組中Erbin、E-cadherin、α-SMA蛋白表達(dá);在 Erbin質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24h后,給予10ng/ml TGF-β1刺激72h,Western blot及免疫熒光檢測(cè)正常組、TGF-β刺激組、Erbin轉(zhuǎn)染組、Erbin+TGF-β1刺激組中Erbin、E-cadherin、α-SMA蛋白表達(dá);ELISA檢測(cè)上述各組中纖維連接蛋白(Fibronectin, FN)的分泌情況。同時(shí),我們還根據(jù) Geenbank設(shè)計(jì)了人 E

11、rbin靶向性 siRNA,用脂質(zhì)體2000將 Erbin siRNA轉(zhuǎn)染至大鼠近端腎小管上皮細(xì)胞(NRK52E細(xì)胞)72 h后,Western blot檢測(cè)正常組、Erbin siRNA轉(zhuǎn)染組中Erbin、E-cadherin、α-SMA蛋白表達(dá);在 Erbin siRNA轉(zhuǎn)染24h后,給予10ng/ml TGF-β1刺激72h,Western blot及免疫熒光檢測(cè)正常組、TGF-β1刺激組、Erbin siRNA轉(zhuǎn)染組、Erbin

12、 siRNA+TGF-β1刺激組中Erbin、E-cadherin、α-SMA蛋白表達(dá)和分布;ELISA檢測(cè)上述各組中纖維連接蛋白(Fibronectin, FN)的分泌情況。
　　結(jié)果：與正常組和空載體轉(zhuǎn)染組相比,Erbin質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組中Erbin表達(dá)明顯增強(qiáng),但在沒有 TGF-β1刺激情況下,高表達(dá) Erbin對(duì) EMT標(biāo)志物 E-cadherin以及α-SMA表達(dá)并沒有影響。給予 TGF-β刺激后,細(xì)胞內(nèi) E-cadherin

13、表達(dá)減少, Erbin及α-SMA表達(dá)明顯增強(qiáng)。而在 Erbin轉(zhuǎn)染組,TGF-β1刺激誘導(dǎo) EMT的作用明顯減弱。免疫熒光結(jié)果顯示 TGF-β1刺激后,細(xì)胞連接處的E-cadherin表達(dá)明顯減少,而Erbin轉(zhuǎn)染組細(xì)胞連接處的E-cadherin較單獨(dú) TGF-β1刺激組明顯增加。ELISA結(jié)果顯示 TGF-β1刺激組 FN的分泌較對(duì)照組明顯增加,而Erbin質(zhì)粒轉(zhuǎn)染則可有效抑制TGF-β1對(duì) FN分泌的促進(jìn)作用。同時(shí),與 Erbi

14、n高表達(dá)一樣,在沒有 TGF-β1作用下,Erbin siRNA雖然可以有效沉默 Erbin的表達(dá),但并不能影響 E-candherin及α-SMA的表達(dá)。而給予 TGF-β1刺激后,Erbin低表達(dá)組 E-cadherin表達(dá)較單獨(dú) TGF-β1刺激組進(jìn)一步減少,α-SMA則進(jìn)一步增加。免疫熒光結(jié)果顯示同時(shí)給予 Erbin siRNA和TGF-β1刺激時(shí),細(xì)胞連接處的E-cadherin表達(dá)較單獨(dú) TGF-β1刺激組進(jìn)一步減少。ELI

15、SA結(jié)果表明 Erbin低表達(dá)可進(jìn)一步增強(qiáng) TGF-β1對(duì) FN分泌的促進(jìn)作用。
　　結(jié)論：高表達(dá) Erbin可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的EMT,而低表達(dá) Erbin則可以促進(jìn) TGF-β1誘導(dǎo)的EMT進(jìn)程。我們的研究結(jié)果表明 Erbin在 TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中發(fā)揮重要的保護(hù)性作用。
　　第三部分 Erbin調(diào)節(jié) TGF-β1誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的信號(hào)機(jī)制研究
　　目的：探討 Erbin對(duì) TGF

16、-β/Smad及TGF-β/ERK信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用,明確Erbin調(diào)節(jié) TGF-β1誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的具體信號(hào)機(jī)制。
　　方法：用10ng/ml TGF-β1刺激 NRK52E細(xì)胞(0、15min、30min、60min、120min、240min),Western blot檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn) Smad2及ERK磷酸化水平;采用脂質(zhì)體2000將含人全長(zhǎng) Erbin基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至大鼠近端腎小管上皮細(xì)胞(NRK52E),West

17、ern blot檢測(cè) TGF-β1刺激后 Erbin高表達(dá)對(duì)細(xì)胞內(nèi) p-Smad2、p-ERK表達(dá)及Smad2/3復(fù)合物入核情況的影響。同時(shí)我們還采用脂質(zhì)體2000將Erbin特異性 siRNA轉(zhuǎn)染至 NRK52E,建立 Erbin低表達(dá)的細(xì)胞模型,Western blot檢測(cè) Erbin低表達(dá)對(duì) TGF-β/ERK信號(hào)通路的影響。為進(jìn)一步檢測(cè)明確 ERK信號(hào)通路的激活為 Erbin調(diào)節(jié) TGF-β1誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化所必需,我們

18、在TGF-β1刺激前1h,給予 MEK1/2抑制劑 U0126(1μM),Western blot檢測(cè)正常組、TGF-β1刺激組、TGF-β1+ U0126刺激組、Erbin siRNA+TGF-β1組、Erbin siRNA+TGF-β1+ U0126組中p-ERK、t-ERK、Erbin、E-cadherin、α-SMA的表達(dá)變化,免疫熒光和ELISA分別檢測(cè)上述各組中E-cadherin表達(dá)和纖維連接蛋白FN分泌情況。
　　

19、結(jié)果：在 NRK52E細(xì)胞中,TGF-β1刺激15min即可激活 Smad2,30min達(dá)到高峰,然后隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng) p-Smad2逐漸失活。TGF-β刺激后,胞漿內(nèi)Smad2/3復(fù)合物減少,核內(nèi) Smad2/3復(fù)合物則明顯增加。與單獨(dú) TGF-β1刺激組相比,高表達(dá) Erbin并不能影響 Smad2磷酸化水平和Smad2/3復(fù)合物入核情況。在 Erbin對(duì) TGF-β1/ERK信號(hào)通路的研究中,我們發(fā)現(xiàn) TGF-β刺激30 min

20、即可激活ERK,60 min時(shí)候ERK磷酸化達(dá)到高峰。高表達(dá)Erbin可有效的抑制TGF-β1刺激引起的ERK磷酸化;相反,Erbin低表達(dá)可顯著增強(qiáng) TGF-β1刺激引起的ERK磷酸化。同時(shí),在給予 MEK1/2抑制劑 U0126之后,無論 Erbin低表達(dá)組還是單獨(dú) TGF-β1刺激組,ERK磷酸化水平均可被有效的抑制。除此之外,我們還發(fā)現(xiàn)給予 U0126之后,Erbin低表達(dá)加 TGF-β1刺激組 E-cadherin表達(dá)增加,α