1，25(OH)-,2-D-,3-對(duì)TGF-β-,1-誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的干預(yù)效應(yīng)及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的:腎小管間質(zhì)纖維化是各種慢性腎臟疾病發(fā)展到終末期腎功能衰竭的共同途徑。腎小管上皮細(xì)胞.間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(Tubular epithelial-mesenchymal transition,TEMT)在腎小管間質(zhì)纖維化的進(jìn)展中起著重要作用。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growthfactor-β1,TGF-β1)被認(rèn)為是致腎臟纖維化最重要的作用因子之一,可以促進(jìn)TEMT的發(fā)生。Smads蛋白是TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中

2、最重要的胞內(nèi)效應(yīng)因子之一,它能將TGF-β信號(hào)由胞膜轉(zhuǎn)入核內(nèi)。Smad3過度表達(dá)及Smad7被抑制是腎臟纖維化的主要因?yàn)椤?,25-二羥維生素D(1,25-dihydroxyvitamin D3,1,25(OH)2D3)是體內(nèi)最重要的維生素D活性產(chǎn)物,通過與其受體-維生素D受體(vitamin Dreceptor,VDR)結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。已有研究表明1,25(OH)2D3可以改善腎臟纖維化,但尚未有關(guān)其改善TEMT分子機(jī)制的報(bào)道。本

3、實(shí)驗(yàn)通過檢測1,25(OH)2D3對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過程中的E.鈣粘蛋白(E-Cadherin,E-Cad)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smoom muscle actin,α-SMA)、VDR、Smad3、Smad7蛋白及mRNA的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化,探討1,25(OH)2D3對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的干預(yù)效應(yīng)及其分子機(jī)制,為臨床腎臟纖維化的藥物治療提供更多的理論依據(jù)。方法:體外培養(yǎng)正常人腎小管上皮細(xì)胞(

4、HK-2細(xì)胞株)。將細(xì)胞隨機(jī)分為5組:正常對(duì)照組(N)、TGF-β1(5ng/ml)組(T)、TGF-β1(5ng/ml)+1,25(OH)2D3(10-9mol/L)(D1)、TGF—β1(5ng/ml)+1,25(OH)2D3(10-8mol/L)組(D2)、TGF-β1(5ng/ml)+1,25(OH)2D3(10-7mol/L)組(D3)。每組設(shè)三復(fù)孔,分別于加入干預(yù)因素后12h、24h、48h、72h,使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形

5、態(tài)學(xué)變化,免疫組化法和Real-time PCR法檢測α-SMA、E-cadherin、VDR、Smad3、Smad7蛋白及mRNA的表達(dá)變化。結(jié)果:(1)與正常對(duì)照組相比,在12h、24h、48h、72h,TGF-β1(5ng/ml)誘導(dǎo)組細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變,從原有典型的鋪路石樣上皮細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)殚L梭形類似成纖維細(xì)胞的形態(tài),且呈時(shí)間依賴關(guān)系；免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果提示α-SMA、Smad3蛋白的表達(dá)隨時(shí)間明顯增加(P<0.05),E-cadh

6、erin、VDR、Smad7蛋白的表達(dá)則隨時(shí)間逐漸減少(P<0.05)；Realtime-PCR結(jié)果示α-SMA、Smad3、Smad7 mRNA的表達(dá)隨時(shí)間明顯增加(P<0.05),E-cadherin、VDR mRNA的表達(dá)則隨時(shí)間逐漸減少(P<0.05)。(2)與TGF-β1(5ng/ml)誘導(dǎo)組相比,除D1組在培養(yǎng)12h和24h后仍可見大部分HK-2細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞樣形態(tài)外,其余各1,25(OH)2D3干預(yù)組均不同程度的抑制了T

7、GF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變；免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果同樣顯示除D1組在培養(yǎng)12h和24h后α—SMA、E—cadherin、VDR、Smad3、Smad7蛋白表達(dá)與TGF-β1(5ng/ml)誘導(dǎo)組相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)外,其余各1,25(OH)2D3干預(yù)組α-SMA、Smad3蛋白的表達(dá)下調(diào)(P<0.05),呈劑量依賴關(guān)系,E-cadherin、VDR、Smad7蛋白的表達(dá)則明顯上調(diào)(P<0.05),亦呈劑量依賴關(guān)系；Real