益氣活血降濁方對TGF-β1誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的作用機(jī)制研究.pdf

1、1研究背景：
　　腎間質(zhì)纖維化(renal interstitial fibrosis，RIF)是各種腎臟疾病進(jìn)展至終末期腎衰竭的共同表現(xiàn)和主要病理基礎(chǔ)。其病理改變主要是腎小管萎縮、炎癥細(xì)胞浸潤和過多的纖維成分在腎小管間質(zhì)廣泛沉積，它以過量細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)如膠原Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型、纖維連接蛋白和層連蛋白在腎間質(zhì)積聚及腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞增生為特征。其特征為結(jié)締組織沉積于腎實(shí)質(zhì)損傷腎臟。其核心是腎小管上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(EMT)，EMT是

2、腎小管腎細(xì)胞失去上皮細(xì)胞表型特征并表現(xiàn)出轉(zhuǎn)型能力，并生成細(xì)胞外基質(zhì)的過程。肌成纖維細(xì)胞(myofibroblast，MyoF)大量活化、增殖是RIF的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，腎小管上皮細(xì)胞-肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(epithelial-mesenchymal transition，簡稱EMT)在RIF的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，因此，抑制EMT可以有效延緩甚至逆轉(zhuǎn)腎小管纖維化過程。但是，針對這一關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)，目前尚無有效的治療方法。中醫(yī)藥治療慢性腎纖

3、維化具有療效好、副作用小的優(yōu)勢。因此，深入研究中醫(yī)益氣活血降濁方對EMT的作用對中醫(yī)藥防治腎纖維化有重要意義。
　　中醫(yī)認(rèn)為，本病的病機(jī)以脾腎虧虛為本，濕瘀互阻為標(biāo)。治療以扶正祛邪，標(biāo)本兼治，治則為益氣活血，利濕降濁。以戴希文為首的老一輩腎病專家通過對大量CRF病例觀察研究出以益氣活血降濁法為主的益腎降壓方(生黃芪、當(dāng)歸、川芎、赤芍、大黃等)。前期臨床研究發(fā)現(xiàn)該方確能延緩慢性腎衰竭的進(jìn)展，改善病人生活質(zhì)量，減少終點(diǎn)事件發(fā)生。基礎(chǔ)研

4、究發(fā)現(xiàn)益氣活血法可以通過降低TGF-β1、提高smad6、7的表達(dá)；恢復(fù)基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制因子間的平衡；減少細(xì)胞外基質(zhì)的異常積聚減輕或抑制了腎纖維化進(jìn)程，有效延緩腎衰大鼠進(jìn)行性的腎功能損害。
　　2研究目的：
　　通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路TGF-β1/smads、p38MAPK、Rho-ROCK等途徑研究益氣活血法對EMT抑制作用的分子機(jī)制，來闡明益氣活血法防治腎纖維化的作用機(jī)制，尋找益氣活血法防治腎纖維化的作用的具體靶點(diǎn)和不同

5、劑量對治療的差異，找出腎纖維化最佳的治療方案，為中醫(yī)治療腎纖維化以及慢性腎功能衰竭奠定較為堅實(shí)的理論基礎(chǔ)。
　　3研究內(nèi)容與方法：
　　本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上，從整體、細(xì)胞、基因水平、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，利用細(xì)胞培養(yǎng)的體外試驗(yàn)，應(yīng)用電鏡、免疫組化、RT-PCR、Western-blot等技術(shù)，多層次探討益氣活血法防治腎纖維化的作用機(jī)制和具體靶點(diǎn)，為中醫(yī)藥治療腎纖維化和慢性腎衰竭提供科學(xué)依據(jù)。
　　4結(jié)果：
　　4.1細(xì)

6、胞形態(tài)學(xué)方面
　　中藥含藥血清有逆轉(zhuǎn)TGF-β1刺激HK-2細(xì)胞EMT的趨勢，以含藥血清大劑量組為效果最為明顯。
　　4.2調(diào)控蛋白表達(dá)方面
　　首先，益氣活血降濁方能抑制肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志性蛋白α-SMA的表達(dá)，并恢復(fù)上皮細(xì)胞標(biāo)志性蛋白E-cadherin的表達(dá)；其次，該方可明顯抑制TGF/smads通路中的關(guān)鍵分子Smad2/3、Smad6、Smad7的表達(dá)從而抑制EMT進(jìn)程。
　　4.3細(xì)胞因子方面
　

7、　益氣活血降濁方可以通過調(diào)節(jié)與腎小管上皮細(xì)胞中與EMT相關(guān)的細(xì)胞因子TGF-β1、HGF、BMP-7、ILK、CTGF、Ⅰ型膠原的表達(dá)，來干預(yù)腎小管上皮細(xì)胞的EMT進(jìn)程。
　　4.4調(diào)控DNA表達(dá)方面
　　調(diào)控rhoA和p38基因的表達(dá)未發(fā)現(xiàn)明顯改變，但中藥中劑量組對p38 MAPK基因的表達(dá)可能有抑制作用。
　　5結(jié)論：
　　益氣活血降濁方能抑制肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志性蛋白α-SMA的表達(dá)，抑制TGF/smads通路