腎纖康通過TGF-β1-Smads信號通路干預(yù)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的研究.pdf

1、目的：
　　采用體外培養(yǎng)細(xì)胞的方法，觀察中藥復(fù)方腎纖康對轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）刺激大鼠腎小管上皮細(xì)胞（NRK-52E）轉(zhuǎn)分化的作用，從細(xì)胞分子水平探討腎纖康對腎間質(zhì)纖維化的作用及其機制。
　　方法：
　　采用腎纖康及鹽酸貝那普利片給大鼠灌胃，每天分灌2次，持續(xù)5天。5天后大鼠腹主動脈采血，分離血清，即得相應(yīng)藥物含藥血清。體外培養(yǎng)NRK-52E細(xì)胞，

2、培養(yǎng)基為含有10％胎牛血清的DMEM/High-glouse培養(yǎng)基。將NRK-52E細(xì)胞分為6組：正常對照組（A組，10%正常大鼠血清）、模型組（B組）、低劑量組（C組，2.5%腎纖康含藥血清）、中劑量組（D組，5%腎纖康含藥血清）、高劑量組（E組，10%腎纖康含藥血清）、貝那普利組（F組，10%貝那普利含藥血清）。后5組均用10ng/ml的TGF-β1誘導(dǎo)刺激，經(jīng)藥物干預(yù)細(xì)胞72h后，觀察藥物對 NRK-52E細(xì)胞形態(tài)的影響，采用免疫

3、熒光技術(shù)檢測α-SMA、Smad3、Smad7蛋白的表達情況，Real-time PCR檢測α-SMA、TGF-β1、Smad3、Smad7 mRNA的表達水平。
　　結(jié)果：
　　1、正常大鼠血清、腎纖康及鹽酸貝那普利含藥血清均不影響體外培養(yǎng)的NRK-52 E細(xì)胞的正常生長。
　　2、細(xì)胞形態(tài)變化：A組細(xì)胞呈多邊形或卵圓形，在培養(yǎng)皿上展現(xiàn)出“鋪路石”一樣的形態(tài)；B組很大部分細(xì)胞失去原有形態(tài)，呈梭形，排列不緊密，局部交織

4、，狀似漁網(wǎng)；C組大部分細(xì)胞呈梭形，少部分呈“鋪路石”狀；D組一部分細(xì)胞呈卵圓形，另一部分仍為梭形；E組大部分細(xì)胞形態(tài)仍為卵圓形，少部分細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樗笮?；F組細(xì)胞形態(tài)與E組大致相同。
　　3、免疫熒光結(jié)果：A組中幾乎未見α-SMA蛋白表達，少量Smad3蛋白表達在胞漿中，胞核中幾乎無Smad3蛋白表達，Smad7蛋白則大量表達在胞漿和胞核中。B組胞漿中可見大量α-SMA蛋白表達，Smad3蛋白在胞漿、胞核中表達均較A組明顯增加，而

5、Smad7蛋白的表達與A組比較則明顯減少。與B組比較，C組、D組、E組中α-SMA、Smad3蛋白表達均隨著腎纖康劑量的遞增而減少，Smad7蛋白的表達則隨腎纖康劑量的遞增而增加；F組中可見少部分α-SMA、Smad3蛋白表達，同時可見大部分Smad7蛋白表達。其中E組α-SMA、Smad3、Smad7的表達情況與F組大致相同。
　　4、Real-time PCR結(jié)果：A組少量α-SMA、TGF-β1、Smad3 m RNA和大量

6、Smad7 mRNA表達；與A組比較，B組α-SMA、TGF-β1、Smad3 m RNA的表達量增加（P＜0.05），Smad7 m RNA的表達量減少（P＜0.05）；與B組相比，C組、D組、E組、F組TGF-β1、α-SMA、Smad3 m RNA的表達量均有所減少（P＜0.05），Smad7 m RNA的表達量均有所增加（P＜0.05），且這種變化在腎纖康各劑量組呈現(xiàn)出劑量依賴性的變化趨勢。
　　結(jié)論：
　　1.腎纖