腎小管上皮細胞轉分化的干細胞機制研究.pdf

1、腎小管間質纖維化(renal interstitial fibrosis，RIF)是各種慢性腎臟疾病進展到終末期腎功能衰竭(end stage renal disease，ESRD)的主要病理基礎，決定了腎臟纖維化的發(fā)展進程。因此研究腎小管間質纖維化的機制已經成為了腎臟病界研究的熱點。
　　 研究表明，腎小管上皮細胞-間充質轉分化(epithelial to mesenchymal trans-differentiation，E

2、MT)為RIF發(fā)生的重要機制。上皮細胞在特定的病理情況下，可通過上皮細胞-肌成纖維細胞間的逆向分化成為具有多向分化潛能的間充質細胞，即EMT。在這一過程中，腎小管上皮細胞失去上皮細胞的表型，獲得新的間充質細胞的特點，如鈣粘素(E-cadherin)的表達減少、重新表達α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)。根據本課題組前期試驗研究結果，上皮細胞逆向分化過程中一過性表達干細胞標記物CD133，本文推斷

3、腎小管上皮細胞逆向分化可能存在干細胞機制：上皮細胞逆向分化為間充質細胞，間充質細胞獲得組織干細胞潛能，在后續(xù)信號的特定作用下，分別向腎小管細胞，抑或肌成纖維細胞分化，起積極/消極的修復作用。
　　 目的：為了進一步研究腎小管上皮細胞轉分化過程中是否有干細胞生成，試圖闡明EMT的可能干細胞機制；探討終止EMT的策略和方法，為最終阻止腎纖維化提供實驗室依據和理論基礎。本研究在體外建立EMT細胞模型，重點研究干細胞標記物Oct-4、C

4、D24基因在腎小管上皮細胞轉分化中的表達情況。
　　 方法：采用10-9mol/L血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)刺激體外培養(yǎng)的正常大鼠腎小管上皮細胞(NRK-52E)。建立腎小管上皮細胞轉分化細胞模型。實驗分為空白組，AngⅡ誘導組，每組設3復孔，共培養(yǎng)3d。用倒置相差顯微鏡、掃描電鏡、透射電鏡觀察細胞形態(tài)和超微結構。AngⅡ誘導組設10個刺激時間點，在刺激的不同時間點提取細胞的RNA和蛋白質，分別采用RT

5、-PCR和Western blot 方法檢測間充質細胞標志α-SMA、上皮細胞標志E-cadherin、胚胎干細胞標記物Oct-4、腎臟干細胞標記物CD24 mRNA和蛋白質的表達，并研究其時效性表達變化規(guī)律。制備各個刺激時間點的細胞爬片，采用細胞間接免疫熒光法定性檢測α-SMA、E-cadherin、Oct-4、CD24的蛋白表達。
　　 結果：培養(yǎng)3d后，AngⅡ誘導組細胞形態(tài)學發(fā)生改變，從原有典型的上皮細胞形態(tài)轉變?yōu)殚L梭形

6、類似成纖維細胞的形態(tài)，失去原有的細胞極性，微絨毛結構基本丟失；并出現肌成纖維細胞所具有的微絲束和致密體。RT-PCR結果顯示，AngⅡ刺激10min時開始產生α-SMA，隨AngⅡ刺激時間的延長，α-SMA的表達逐漸增加，顯著高于對照組，差異有顯著性意義(P＜0.05)。而E-cadherin的表達逐漸下調，顯著低于對照組，差異有顯著性意義(P＜0.05)。Western blot和細胞免疫熒光結果一致，α-SMA蛋白在刺激1h開始表達

7、，隨時間的延長，表達逐漸增加，而E-cadherin蛋白的表達逐漸下調，與mRNA表達趨勢一致。α-SMA、E-cadherin 的表達變化存在時間依賴性方式。提示腎小管上皮細胞轉分化細胞模型成功建立。AngⅡ刺激25min，NRK-52E細胞開始表達Oct-4 mRNA和CD24 mRNA，1h表達量最高，4h后消失。Westem blot和細胞免疫熒光顯示相似的變化規(guī)律，AngⅡ刺激1h，NRK-52E細胞開始表達Oct-4和CD2

8、4蛋白，4h表達量最高。而空白對照組均不表達Oct-4和CD24。刺激組Oct-4和CD24的表達顯著高于對照組，有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。Oct-4、CD24表達的規(guī)律一致，表達量呈時間依賴。
　　 結論：
　　 (1)成功建立腎小管上皮細胞轉分化細胞模型。
　　 (2)在腎小管上皮細胞轉分化細胞模型中，上皮細胞標志E-cadherin表達逐漸下調，間充質細胞的標志α-SMA表達逐漸上調，腎小管上皮細胞發(fā)生