miR-200a調(diào)控β-catenin在腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中的作用.pdf

1、目的:
　　本課題用TGF-β1誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化，觀察miR-200a和β-catenin的表達(dá)變化;用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)證實(shí)miR-200a以β-catenin的基因CTNNB1為靶標(biāo);以外源性干預(yù)miR-200a的表達(dá)，觀察其對(duì)β-catenin和上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的影響;用干擾RNA阻斷β-catenin表達(dá)，反證β-catenin在miR-200a調(diào)控小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化中的重要作用。確立miR-200a直接以

2、β-catenin為靶點(diǎn)調(diào)控小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化。這為干預(yù)腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為腎間質(zhì)纖維化的治療提供新靶點(diǎn)。
　　方法:
　　1.TGF-β1誘導(dǎo)對(duì)體外培養(yǎng)HK-2細(xì)胞miR-200a和β-catenin的影響，將HK-2細(xì)胞，分為0h組、12h組、24h組、48h組，用終濃度為10ng/ml的TGF-β1分別作用12h、24h、48h; qPCR檢測(cè)各組miR-200a的表達(dá)，qPCR和Western B

3、lot檢測(cè)各組HK-2細(xì)胞β-catenin、E-cadherin、α-SMA和FN的mRNA和蛋白表達(dá)情況。
　　2.agomir(miR-200a激動(dòng)劑)和antagomir(miR-200a抑制劑)對(duì)HK-2細(xì)胞miR-200a表達(dá)的影響，HK-2細(xì)胞分為4組，48h后qPCR檢測(cè)miR-200a的表達(dá)情況。
　　3.運(yùn)用雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒（β-catenin基因野生型/突變型，CTNNB1 UTR WT/MT）驗(yàn)證m

4、iR-200a與β-catenin的作用靶點(diǎn)關(guān)系，HK-2細(xì)胞分為4組，48h后雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光活性。
　　4.上調(diào)miR-200a(agomir)對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的β-catenin及小管EMT的影響，HK-2細(xì)胞分為4組，48h后qPCR和Western Blot檢測(cè)細(xì)胞β-catenin、E-cadherin、α-SMA和FN的mRNA和蛋白表達(dá)情況，細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)E-cadherin和α-SMA的表達(dá)情況。

5、
　　5.下調(diào)miR-200a(antagomir)對(duì)β-catenin及小管EMT的影響，HK-2細(xì)胞分為3組，48h后qPCR和WesternBlot檢測(cè)細(xì)胞β-catenin、E-cadherin、α-SMA和FN的mRNA和蛋白表達(dá)情況，細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)E-cadherin和α-SMA的表達(dá)情況。
　　6.β-catenin siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞β-catenin的影響，HK-2細(xì)胞分為3組，各組細(xì)胞培養(yǎng)至48h進(jìn)行

6、qPCR和Western Blot檢測(cè)β-catenin表達(dá)。
　　7.干擾β-catenin對(duì)antagomir誘導(dǎo)的EMT的影響，HK-2細(xì)胞分為4組，48h后qPCR和Western Blot檢測(cè)細(xì)胞E-cadherin、α-SMA和FN的mRNA和蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.TGF-β1誘導(dǎo)下細(xì)胞miR-200a、β-catenin及轉(zhuǎn)分化指標(biāo)的表達(dá)情況qPCR檢測(cè)結(jié)果示miR-200a在0h組呈高表達(dá)

7、，提示在TGF-β1誘導(dǎo)小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化中miR-200a表達(dá)下調(diào)，而β-catenin表達(dá)上調(diào)。
　　2.agomir(miR-200a激動(dòng)劑)和antagomir(miR-200a抑制劑)對(duì)HK-2細(xì)胞miR-200a表達(dá)的影響
　　qPCR檢測(cè)結(jié)果示，miR-200a的表達(dá)在NC-miRNA組與control組無(wú)明顯差別(P＞0.05);在agomir組miR-200a表達(dá)較NC-miRNA組明顯增多(P＜0.05)

8、，在antagomir組其表達(dá)較NC-miRNA組明顯減少(P＜0.05)。提示agomir上調(diào)miR-200a表達(dá)，antagomir下調(diào)miR-200a表達(dá)。
　　3.雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-200a與β-catenin的作用靶點(diǎn)
　　雙熒光素酶檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染CTNNB1 UTR MT質(zhì)粒的各組間相對(duì)熒光活性比值無(wú)明顯差異(P＞0.05);轉(zhuǎn)染CTNNB1 UTR WT質(zhì)粒的各組，control組和NC-miRNA

9、組無(wú)明顯差異，但在antagomir組熒光活性比值較NC-miRNA組明顯升高(P＜0.05)，在agomir組熒光活性比值較NC-miRNA組明顯降低(P＜0.05)。提示miR-200a直接以β-catenin的基因CTNNB1為靶標(biāo)。
　　4.上調(diào)miR-200a(agomir)對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的β-catenin及小管EMT的影響
　　細(xì)胞β-catenin、E-cadherin、α-SMA和FN的mRNA和蛋白表

10、達(dá)在TGF-β1組和NC-miRNA+TGF-β1組之間無(wú)明顯差異(P＞0.05);在TGF-β1組，β-catenin、α-SMA和FN的mRNA和蛋白表達(dá)較control組明顯增多(P＜0.05)，E-cadherin的mRNA和蛋白表達(dá)較control組明顯減少(P＜0.05);在agomir+TGF-β1組，β-catenin、α-SMA和FN的mRNA和蛋白表達(dá)較NC-miRNA+TGF-β1組明顯下調(diào)(P＜0.05)，同時(shí)較

11、TGF-β1組明顯下調(diào)(P＜0.05)，E-cadherin的mRNA和蛋白表達(dá)則較NC-miRNA+TGF-β1組明顯上調(diào)(P＜0.05)，同時(shí)較TGF-β1組明顯上調(diào)(P＜0.05)。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果與蛋白結(jié)果一致，即E-cadherin熒光在TGF-β1組較control組顯著減弱，在agomir+TGF-β1組則較NC-miRNA+TGF-β1組明顯增強(qiáng);α-SMA熒光在TGF-β1組較control組明顯增強(qiáng)，在agomir+

12、TGF-β1組則較NC-miRNA+TGF-β1組顯著減弱。提示上調(diào)miR-200a減弱TGF-β1誘導(dǎo)的β-catenin表達(dá)，抑制小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化
　　5.下調(diào)miR-200a(antagomir)對(duì)β-catenin及小管EMT的影響
　　細(xì)胞β-catenin、E-cadherin、α-SMA和FN的mRNA和蛋白表達(dá)在control組與在NC-miRNA組無(wú)明顯差別(P＞0.05);在antagomir組，β-c

13、atenin、α-SMA和FN的mRNA和蛋白表達(dá)較NC-miRNA組明顯升高(P＜0.05); E-cadherin的mRNA和蛋白表達(dá)則較NC-miRNA組明顯降低(P＜0.05)。細(xì)胞免疫熒光顯示，在control組和NC-miRNA組，E-cadherin出現(xiàn)明顯紅色熒光，α-SMA則有少許微弱的熒光;在antagomir組E-cadherin熒光明顯減弱，α-SMA熒光顯著增強(qiáng)。提示下調(diào)miR-200a可增加β-catenin

14、表達(dá)，促進(jìn)小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化。
　　6.β-catenin siRNA對(duì)細(xì)胞β-catenin表達(dá)的影響
　　在control組和NC-siRNA組β-catenin的mRNA表達(dá)無(wú)明顯差別(P＞0.05)，但在siR-β-catenin組，β-catenin表達(dá)較NC-siRNA組明顯下調(diào)(P＜0.05); Western Blot結(jié)果與qPCR結(jié)果相符，即β-catenin表達(dá)在control組和NC-siRNA組正常表

15、達(dá)，但在siR-β-catenin組較NC-siRNA組表達(dá)顯著減少(P＜0.05)。提示β-catenin siRNA抑制β-catenin表達(dá)。
　　7.干擾β-catenin對(duì)antagomir誘導(dǎo)的小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的影響
　　細(xì)胞E-cadherin、α-SMA和FN的mRNA和蛋白表達(dá)在antagomir組與antagomir+NC-siRNA組無(wú)明顯差異(P＞0.05);在antagomir組，E-cadher

16、in的mRNA和蛋白表達(dá)較control組顯著減少(P＜0.05)，α-SMA和FN的mRNA和蛋白表達(dá)則較control組顯著增加;在antagomir+siR-β-catenin組，E-cadherin的mRNA和蛋白表達(dá)較antagomir+NC-siRNA組表達(dá)上調(diào)(P＜0.05);α-SMA和FN的mRNA和蛋白表達(dá)則較antagomir+NC-siRNA組表達(dá)下調(diào)(P＜0.05)。提示β-catenin siRNA抑制ant

17、agomir誘導(dǎo)的小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化，反證了miR-200a直接調(diào)控β-catenin影響腎小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化
　　結(jié)論:
　　1.在TGF-β1誘導(dǎo)小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化中miR-200a表達(dá)下調(diào)，而β-catenin表達(dá)上調(diào);
　　2.miR-200a直接以β-catenin的基因CTNNB1為靶標(biāo);
　　3.上調(diào)miR-200a減弱TGF-β1誘導(dǎo)的β-catenin表達(dá)，抑制小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化;下調(diào)miR-2