HSP47在腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中的作用與機(jī)制研究.pdf

1、背景：腎間質(zhì)纖維化(renal interstitial fibrosis，RIF)是慢性腎臟疾病(chronic kidney disease，CKD)進(jìn)展到終末期腎臟疾病(end stagerenal disease，ESRD)的共同通路和最主要病理改變之一。大量動(dòng)物及臨床實(shí)驗(yàn)表明，在各種原發(fā)和繼發(fā)性。腎臟疾病中，腎間質(zhì)纖維化程度比腎小球硬化程度與腎功能的關(guān)系更為密切，是反映腎功能下降嚴(yán)重程度和判斷預(yù)后最重要的指標(biāo)。腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)

2、分化(epithelialto mesenchymal transition，EMT)是腎間質(zhì)纖維化的早期且可逆階段，細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)沉積是腎間質(zhì)纖維化的主要組織學(xué)改變。研究表明轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor，TGF-β1)在這一過程中起關(guān)鍵作用。TGF-β1/Smad2-3信號(hào)通路是TGF-β1誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞EMT及ECM沉積的主要途徑。

3、>　　 熱休克蛋白47(heat shock protein47，HSP47)是熱休克蛋白家族的一種膠原特異性分子伴侶，能與多種類型的膠原和前膠原特異性結(jié)合，調(diào)控膠原的表達(dá)，在多種器官纖維化過程中起重要作用。研究顯示HSP47過度表達(dá)與腎臟纖維化密切相關(guān)，并成為腎臟纖維防治的目標(biāo)之一。HSP47主要表達(dá)于表型轉(zhuǎn)化的腎小管上皮細(xì)胞，受TGF-β1調(diào)控，抑制HSP47表達(dá)能夠減輕腎臟纖維化。腎小管上皮細(xì)胞EMT過程中伴有熱休克蛋白亞族的產(chǎn)

4、生，而熱休克蛋白參與EMT的研究目前尚不多，基于以上分析，我們認(rèn)為HSP47可能與慢性腎臟疾病腎小管上皮細(xì)胞EMT及ECM沉積有關(guān)。因此，本實(shí)驗(yàn)從體內(nèi)體外兩方面研究腎小管上皮細(xì)胞EMT中HSP47的作用，并進(jìn)一步闡述其可能的作用機(jī)制。
　　 第一章：HSP47在UUO模型大鼠中的表達(dá)及其對(duì)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響
　　 目的：闡明HSP47在UUO模型大鼠腎小管上皮細(xì)胞EMT及ECM沉積中的作用，探討以HSP47為靶點(diǎn)

5、抑制腎小管上皮細(xì)胞EMT及ECM沉積的策略。
　　 方法：12周齡SD雄性大鼠，體重280～320g。隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組)、UUO模型組(UUO組)、UUO模型+超聲聯(lián)合脂質(zhì)微泡+HSP47反義寡核苷酸(antisense oligonucleotides，antisenseODNs)組(antisenseODNs組)以及UUO模型+超聲聯(lián)合脂質(zhì)微泡+HSP47正義寡核苷酸(sense oligonucleotides

6、，senseODNs)組(senseODNs組)。每組18只，再隨機(jī)分為3天組，7天組，14天組三個(gè)亞組(每組6只)。按分組于第3、7和14天處死大鼠，取結(jié)扎側(cè)腎臟。運(yùn)用HE、Masson染色觀察各組大鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)改變，采用免疫組化方法檢測UUO組大鼠不同時(shí)間腎臟組織HSP47、波形蛋白(Vimentin)、緊密連接蛋白(Zona occludens-1，ZO-1)、Ⅰ型膠原(CollagenⅠ，ColⅠ)的表達(dá)，運(yùn)用Western

7、 blot及Real-time PCR檢測各組大鼠14天時(shí)各組大鼠腎臟組織HSP47、ZO-1、Vimentin、ColⅠ的表達(dá)。
　　 結(jié)果：HE和Masson染色顯示，與Sham組相比，UUO組大鼠隨梗阻時(shí)間延長，腎小管損傷程度、間質(zhì)纖維化程度及炎癥細(xì)胞浸潤逐漸增加(p<0.05)。與UUO組相比，antisenseODNs組上述病變程度較同時(shí)間UUO組減輕(p<0.05)，senseODNs組無明顯差別(p>0.05)。免

8、疫組化顯示，與Sham組相比，UUO組大鼠隨梗阻時(shí)間的延長腎臟組織HSP47、Vimentin、ColⅠ表達(dá)上調(diào)(p<0.05)，而ZO-1表達(dá)下調(diào)(p<0.05)。與Sham組相比，14天時(shí)antisenseODNs組HSP47蛋白及mRNA表達(dá)明顯降低(p<0.05)，同時(shí)ZO-1蛋白及mRNA表達(dá)上調(diào)(p<0.05)，Vimentin、ColⅠ蛋白及mRNA表達(dá)下調(diào)(p<0.05)，纖維化程度減輕；senseODNs組HSP47、

9、ZO-1、Vimentin、ColⅠ蛋白及mRNA表達(dá)無明顯變化(p>0.05)。
　　 結(jié)論：UUO模型大鼠腎小管上皮細(xì)胞EMT及ECM沉積過程中，HSP47表達(dá)上調(diào)；抑制HSP47表達(dá)能部分逆轉(zhuǎn)腎小管上皮細(xì)胞EMT，抑制ECM生成。
　　 第二章：HSP47在腎小管上皮細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響
　　 目的：闡明HSP47在TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞EMT及ECM沉積中

10、的作用，探討以HSP47為靶點(diǎn)抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞EMT及ECM沉積的策略。
　　 方法：用10ng/ml TGF-β1刺激HK-2細(xì)胞(TGF-β1組)，通過細(xì)胞免疫熒光、Western blot及Real-time PCR檢測HSP47、Vimentin、ZO-1的表達(dá)，通過Western blot及Real-time PCR檢測Ⅰ型膠原(CollagenⅠ，ColⅠ)和Ⅳ型膠原(CollagenⅣ，ColⅣ)

11、的表達(dá)；轉(zhuǎn)染HSP47 siRNA(HSP47siRNA組)及HSP47陰性對(duì)照組(HSP47siRNA(-)組)，陰性對(duì)照為無基因抑制效果的一段siRNA，再予TGF-β1刺激，通過細(xì)胞免疫熒光、Western blot檢測HSP47表達(dá)，通過Western blot、Real-time PCR法檢測HK-2細(xì)胞Vimentin、ZO-1、ColⅠ、ColⅣ的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：10ng/ml TGF-β1刺激后，HK-2

12、細(xì)胞Vimentin、ColⅠ和ColⅣ蛋白及mRNA呈時(shí)間依賴性表達(dá)升高(p<0.05)，ZO-1蛋白及mRNA呈時(shí)間依賴性表達(dá)降低(p<0.05)，而HSP47蛋白及mRNA也呈時(shí)間依賴性表達(dá)升高(p<0.05)。與TGF-β1組相比，HSP47siRNA組HK-2細(xì)胞HSP47蛋白及mRNA表達(dá)明顯下調(diào)(p<0.05)，同時(shí)ZO-1蛋白及mRNA表達(dá)上調(diào)(p<0.05)，Vimentin、ColⅠ和ColⅣ蛋白及mRNA表達(dá)下調(diào)(

13、p<0.05)；HSP47siRNA(-)組ZO-1、Vimentin、ColⅠ和ColⅣ的蛋白及mRNA表達(dá)無明顯變化(p>0.05)。
　　 結(jié)論：TGF-β1誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞EMT及ECM沉積過程中伴有HSP47表達(dá)升高；下調(diào)HSP47可部分逆轉(zhuǎn)HK-2細(xì)胞EMT，抑制ECM生成。
　　 第三章：HSP47通過調(diào)節(jié)Smad3的活性參與TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化
　　 目的：闡明HSP47參與調(diào)控

14、TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞EMT及ECM沉積的可能機(jī)制，為靶向HSP47防治腎臟纖維化提供理論依據(jù)。
　　 方法：用10ng/ml TGF-β1刺激HK-2細(xì)胞(TGF-β1組)，通過Western blot方法檢測細(xì)胞中Smad3、p-Smad3的表達(dá)水平；轉(zhuǎn)染HSP47 siRNA(HSP47siRNA組)及HSP47陰性對(duì)照組(HSP47siRNA(-)組)，陰性對(duì)照為無基因抑制效果的一段siRNA，再予TGF-β1

15、刺激，通過Western blot方法檢測Smad3、p-Smad3、HSP47的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：TGF-β1促進(jìn)Smad3磷酸化，上調(diào)p-Smad3/Smad3表達(dá)(p<0.05)，在30分鐘時(shí)達(dá)到峰值，隨后稍下降，在24～48小時(shí)達(dá)到另一峰值。與TGF-β1組相比，HSP47siRNA組HSP47蛋白表達(dá)下降(p<0.05)，同時(shí)p-Smad3/Smad3表達(dá)下調(diào)(p<0.05)；HSP47siRNA(-)組p-Sm