TGF-β1-Smads-ILK信號通路在環(huán)孢素誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中的作用.pdf

1、目的:通過體外特異阻斷試驗(yàn)，觀察TGF-β1/Smads信號通路在環(huán)孢素A致腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中的作用，探討ILK是否作為TGF-β/Smads信號通路下游因子參與腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。
　　 方法:1.構(gòu)建ILK siRNA。2.大鼠腎小管上皮細(xì)胞株(NRK-52E)分設(shè)正常組及CsA誘導(dǎo)組，后者分別采用CsA不同濃度和時間處理，觀察細(xì)胞增殖抑制情況，選擇CsA最佳時間和最適濃度。3.將NRK52E細(xì)胞培養(yǎng)分為5組:空白對照

2、組（A組）:僅加入含10％胎牛血清的H-DMEM培養(yǎng)基;CsA處理組（B組）:細(xì)胞培養(yǎng)液加CsA(1mg/L);干預(yù)1組（C組）:加TGF-β1阻斷劑(SB431542，10umol/L)預(yù)孵一小時后再加入CsA(1mg/L);干預(yù)2組（D組）:轉(zhuǎn)染有效ILKshRNA(KD-ILKshRNA，劑量MOI=20)72h后加入CsA(1mg/L);干預(yù)3組（E組）:轉(zhuǎn)染無效ILKshRNA(NC-ILKshRNA，劑量MOI=20)72h

3、后加入CsA(1mg/L)。上述各組分設(shè)3復(fù)孔，培養(yǎng)48 h。實(shí)時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測TGF-β1以及Smad2、Smad7、ILK、FSP-1mRNA的表達(dá)，蛋白印跡法(Western-blot)檢測TGF-β1、Smad7、ILK、FSP-1的蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果:1.從慢病毒載體pGCSIL-hU6/GFP-ILK-2中擴(kuò)增、重組、酶切后獲得大約7800bp，DNA測序結(jié)果與Genbank中報道的I

4、LK基因序列一致。2.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NRK-52E細(xì)胞后可觀察GFP熒光表達(dá)，Western blot證實(shí)與GFP-ILK-2融合蛋白大小基本一致的陽性條帶;病毒滴度為1×109pfu/ml;RT-PCR檢測其對ILK基因表達(dá)的敲減效率＞80％。3.TGF-β1mRNA及蛋白的表達(dá)情況:與A組比較，CsA處理后的各組細(xì)胞TGF-β1mRNA及蛋白表達(dá)量均顯著增加（P＜0.01），其中C組、D組表達(dá)量顯著低于B組(P＜0.01)，C組的表達(dá)

5、量又顯著低于D組(P＜0.01)而E組與B組表達(dá)量無顯著差異(P＞0.05)。4.Smad2mRNA表達(dá)情況:與A組比較，CsA處理后的各組細(xì)胞Smad2mRNA表達(dá)量均顯著增加(P＜0.01)，其中C組、D組、E組表達(dá)量顯著低于B組(P＜0.01)，C組的表達(dá)量又顯著低于D、E組(P＜0.01)。5.Smad7mRNA及蛋白的表達(dá)情況:與A組比較，CsA處理后各組細(xì)胞Smad7mRNA及蛋白表達(dá)量均顯著降低(P＜0.05)，其中C、D

6、、E組表達(dá)量均顯著高于B組(P＜0.01)，D、E組表達(dá)量又顯著低于C組(P＜0.01)。6.ILKmRNA及蛋白的表達(dá)情況:與A組比較，CsA處理后的各組細(xì)胞ILKmRNA及蛋白表達(dá)量均明顯增加(P＜0.01)，C、D組表達(dá)增加程度顯著低于B組(P＜0.01)，E組與B組表達(dá)量無顯著差異(P＞0.05)，D組表達(dá)量顯著低于C組(P＜0.01)。7.FSP-1mRNA及蛋白的表達(dá)情況:與A組比較，CsA處理后的各組細(xì)胞FSP-1mRNA

7、及蛋白表達(dá)量均顯著增加(P＜0.05)，C組、D組表達(dá)增加程度均顯著低于B組(P＜0.01)，E組表達(dá)量與B組無顯著差異(P＞0.05)，D組表達(dá)量顯著高于C組(P＜0.01)。8.環(huán)孢素誘導(dǎo)腎小管細(xì)胞發(fā)生形態(tài)變化，并成時間劑量依賴關(guān)系。
　　 結(jié)論: TGF-β/Smads信號通路激活是環(huán)孢素A誘導(dǎo)大鼠腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的重要機(jī)制之一，ILK作為TGF-β/Smads信號通路下游效應(yīng)因子參與（至少部分）參與環(huán)孢素A誘導(dǎo)大鼠腎