運(yùn)用RNAi技術(shù)抑制ILK表達(dá)對(duì)CTGF誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響.pdf

1、目的：腎小管間質(zhì)纖維化(Tubulointerstitial fibrosis，TIF)是各種腎臟疾病進(jìn)展到終末期。腎病(end stage kidney disease，ESRD)的共同病理特征。大量研究發(fā)現(xiàn)，腎小管上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelail to mesenchyrreal transition,EMT)在TrF的形成過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。EMT是一個(gè)受多種因子調(diào)節(jié)的過(guò)程，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(conne

2、ctive tissuegrowth factog CTGF)可以直接誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)分化，但是其細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制并不明確。整合素連接激酶(integin linked kinase，ILK)是新近發(fā)現(xiàn)的一種重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子。本研究運(yùn)用RNA干擾(RNA interference，RNAi)方法抑制腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)ILK表達(dá)，觀察阻斷ILK表達(dá)對(duì)人重組CTGF(rhCTGF)引起的腎小管上皮細(xì)胞EMT的影響，初步探討CTG

3、F引起EMT的胞內(nèi)信號(hào)途徑。 方法：化學(xué)合成含有靶向ILK基因的siRNA(small interferencing RNA)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，退火后成為雙鏈DNA，在T<,4>DNA連接酶的作用下與Psilencer 3.1H<,1>質(zhì)粒(含有潮霉素的抗性基因)相連接，經(jīng)測(cè)序鑒定及純化后轉(zhuǎn)染HK.2細(xì)胞。在含潮霉素的培養(yǎng)基中篩選7天，富集成功轉(zhuǎn)染了Psilencer 3.1H<,1>質(zhì)粒的細(xì)胞，分別采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR和Weste

4、rn blot檢測(cè)ILKmRNA和蛋白抑制效果，用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。采用濃度為0-50ng/ml的rhCTGF干預(yù)HK.2細(xì)胞48h后，Wesemblot檢測(cè)ILK蛋白變化，摸索作用最為明顯的濃度，采用此濃度干預(yù)細(xì)胞0-72h觀察rhCTGF影響ILK表達(dá)的時(shí)間效應(yīng)。采用0-50ng/ml rhCTGF干預(yù)細(xì)胞48h/72h后實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)HK-2細(xì)胞E-cadherin、α-SMA mRNA表達(dá)，免疫細(xì)胞化學(xué)和Westemblo

5、t方法檢測(cè)α-SMA蛋白表達(dá)，Westernblot方法檢測(cè)E-cadherin蛋白表達(dá)。細(xì)胞分為4組：空白對(duì)照組(c)，rhCTGF干預(yù)組(CTGF)，轉(zhuǎn)染+rCTGF組(T)，轉(zhuǎn)染對(duì)照+rhCTF組(TC)，觀察抑制ILK表達(dá)對(duì)CTGF作用的影響。實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)HK-2細(xì)胞E.cadherin、α-SMA mRNA表達(dá)變化。Western blot方法檢測(cè)E-cadherin、α-SMA蛋白表達(dá)變化。 結(jié)果：rhC

6、TGF能夠呈濃度時(shí)間依賴性引起HK-2細(xì)胞ILK表達(dá)增加。Psilencer質(zhì)粒轉(zhuǎn)染IlK.2細(xì)胞后改用hygromycin培養(yǎng)7天，富集成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，實(shí)時(shí)定量RT-PCR和Westernblot結(jié)果顯示ILKmRNA和蛋白表達(dá)均明顯抑制(P<0.01)。rhCTGF呈時(shí)間濃度依賴性引起ILK-2細(xì)胞E-cadherin mRNA表達(dá)下降(P<0.05)，α-SMA表達(dá)增加(P<0.05)；呈濃度依賴性引起E-cadherin蛋白丟失

7、(P<0.05)，α-SMA蛋白表達(dá)增加fP<0.05)。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示50ng/ml rhCTGF干預(yù)48h就能引起α-SMA蛋白表達(dá)增加，72h后進(jìn)一步增加。抑制ILK表達(dá)后，與TC組相比，轉(zhuǎn)染Psilencer 3.1 H<,1>質(zhì)粒組E.cadherin mRNA和蛋白表達(dá)的丟失得到明顯抑制(P<0.05)，rhCTGF引起的α-SMA表達(dá)增加也得到明顯抑制(P<0.05)。 結(jié)論： 1. rhCTGF能夠