甲狀旁腺素對人腎小管上皮細胞凋亡和轉分化的影響.pdf

1、目的：腎間質纖維化是各種原因所致的慢性腎臟病進展為終末期腎病的共同途徑。腎小管間質病變的嚴重程度與慢性腎臟病的進展及預后密切相關。因此，對腎間質纖維化發(fā)生、發(fā)展的機制及其防治的研究已成為目前腎臟病領域的研究熱點。作為腎小管間質結構的主要細胞之一，腎小管上皮細胞不僅是疾病進展中的受損者，而且是間質炎癥、纖維化的積極參與者。研究表明，腎小管上皮細胞凋亡和轉分化在腎間質纖維化的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。腎小管上皮細胞凋亡導致腎小管細胞丟失、腎

2、小管萎縮。腎小管上皮細胞向肌成纖維細胞轉分化后，進入腎間質，一方面導致腎小管細胞丟失，腎小管萎縮；另一方面，肌成纖維細胞分泌大量的細胞外基質和細胞因子、趨化因子，促進腎間質纖維化的進展。阻止或逆轉腎小管上皮細胞的凋亡和轉分化過程，可能成為防治腎間質纖維化的新途徑。
　　 在慢性腎臟病早期，多數患者的血清甲狀旁腺素（PTH）水平就已顯著增高。很多腎臟病學者已經認識到過度增高的PTH可看作是一種尿毒癥毒素，不僅影響骨質代謝，導致腎性

3、骨病，而且對心血管系統、神經系統、內分泌系統、免疫系統和紅細胞生成等均產生負性影響，但PTH對腎臟本身的影響，尚未引起足夠的重視。研究表明，某些尿毒癥毒素，如晚期糖基化終末產物、甲基胍、硫酸吲哚酚、瘦素等對腎小管間質的損傷具有加劇作用，從而促進了腎間質纖維化的進展。PTH作為尿毒癥毒素之一，是否影響腎小管上皮細胞凋亡和轉分化過程，目前國內外少見報道。
　　 1，25（OH）2D3，又稱為活性維生素D3，是調節(jié)體內鈣磷代謝的重要激

4、素。最近研究發(fā)現，它還具有調節(jié)細胞的增生、分化、凋亡、以及介導免疫反應等生物學效應。文獻報道，應用1，25（OH）2D3類似物帕立骨化醇（paricalcitol）能夠減輕單側輸尿管梗阻模型的腎小管間質損傷。1，25（OH）2D3能夠抑制TGF-β1誘導的腎間質成纖維細胞α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）和Ⅰ型膠原的表達上調，因此推測1，25（OH）2D3具有抗腎間質纖維化的潛能。但1，25（OH）2D3是否能夠拮抗PTH對腎小管上皮細胞

5、凋亡和轉分化的影響，目前國內外尚未見報道。
　　 本課題利用體外培養(yǎng)的人近端腎小管上皮細胞（HK-2細胞株），研究PTH對其凋亡、轉分化、細胞外基質的分泌和降解、以及致纖維化細胞因子轉化生長因子-β1（TGF-β1）表達的影響，以探討PTH在腎間質纖維化發(fā)病機制中的作用。并進一步研究1，25（OH）2D3對PTH誘導的人腎小管上皮細胞轉分化和TGF-β1表達的拮抗作用，為防治腎間質纖維化提供新的思路。
　　 方法：

6、>　　 1.HK-2細胞的培養(yǎng)及鑒定
　　 HK-2細胞株來源于美國ATCC司，細胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清（FCS）的DMEM/F12培養(yǎng)液中，37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)，每隔1～2天換液1次，應用0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化傳代，每5～6天傳代1次。用倒置相差顯微鏡、掃描電鏡觀察細胞形態(tài)，免疫細胞化學法檢測細胞角蛋白-18（CK-18）、α-SMA的表達以進行細胞鑒定。
　　 2.PTH對HK-2細胞

7、凋亡的影響
　　 （1）藥物干預：將HK-2細胞培養(yǎng)于含5％ FCS的DMEM/F12培養(yǎng)液中，試驗前應用無血清培養(yǎng)液同步化24 h，分別加入終濃度為0、10-12、10-11、10-10、10-9、10-8 mol/L PTH的無血清DMEM/F12培養(yǎng)液刺激HK-2細胞48 h，或10-8 mol/L PTH刺激HK-2細胞不同時間（0、12、24、48、72 h）。
　　 （2）Hoechst33258染色共聚焦顯

8、微鏡觀察HK-2細胞核形態(tài)學的改變。
　　 （3）Annexin V/PI雙染流式細胞術檢測HK-2細胞的凋亡百分率。
　　 （4）Western blot法檢測HK-2細胞中Bax和Bcl-2的蛋白表達。
　　 （5）半定量RT-PCR法檢測HK-2細胞中Bax和Bcl-2的基因表達。
　　 3.PTH對HK-2細胞轉分化和TGF-β1表達的影響
　　 （1）藥物干預：將HK-2細胞培養(yǎng)于含5％

9、 FCS的DMEM/F12培養(yǎng)液中，試驗前應用無血清培養(yǎng)液同步化24 h，分別加入終濃度為0、10-12、10-11、10-10、10-9、10-8 mol/L PTH的含5％ FCS的DMEM/F12培養(yǎng)液刺激HK-2細胞48 h，或10-8 mol/L PTH刺激HK-2細胞不同時間（0、12、24、48、72 h）。
　　 （2）倒置相差顯微鏡、掃描電鏡觀察細胞形態(tài)學改變。
　　 （3）免疫細胞化學法檢測HK-2細

10、胞中α-SMA的表達。
　　 （4）Western blot法檢測細胞中α-SMA、TGF-β1的蛋白表達。
　　 （5）半定量RT-PCR法檢測HK-2細胞中α-SMA、TGF-β1的基因表達。
　　 4.PTH對HK-2細胞細胞外基質的合成與降解的影響
　　 （1）藥物干預：將HK-2細胞培養(yǎng)于含5％ FCS的DMEM/F12培養(yǎng)液中，試驗前應用無血清培養(yǎng)液同步化24 h，分別加入終濃度為0、10-1

11、2、10-11、10-10、10-9、10-8 mol/L PTH的含5％ FCS的DMEM/F12培養(yǎng)液刺激HK-2細胞48 h，或10-8 mol/L PTH刺激HK-2細胞不同時間（0、12、24、48、72 h）。
　　 （2）Western blot法檢測HK-2細胞中Ⅲ型膠原的蛋白表達。
　　 （3）ELISA法檢測HK-2細胞培養(yǎng)上清液中纖維連接蛋白的含量。
　　 （4）半定量RT-PCR法檢測HK

12、-2細胞中Ⅲ型膠原、纖維連接蛋白、纖溶酶原激活物抑制物-1（PAI-1）、基質金屬蛋白酶-1（MMP-1）、金屬蛋白酶組織抑制劑-1（TIMP-1）的基因表達。
　　 51，25（OH）2D3對PTH誘導的HK-2細胞轉分化和TGF-β1表達的影響
　　 （1）藥物干預：HK-2細胞培養(yǎng)于含5％FCS的DMEM/F12培養(yǎng)液中，試驗前應用無血清培養(yǎng)液同步化24 h。實驗分組：（1）對照組，加入等體積含5％FCS的DMEM

13、/F12培養(yǎng)液；（2） PTH刺激組：加入終濃度為10-10mol/L PTH的含5％FCS的DMEM/F12培養(yǎng)液；（3）1，25（OH）2D3干預組：加入10-10 mol/L PTH，同時加入不同濃度（10-10、10-9、10-8、10-7mol/L）的1，25（OH）2D3，刺激HK-2細胞48 h。
　　 （2）免疫細胞化學法檢測HK-2細胞中α-SMA的表達。
　　 （3）Western blot法檢測HK

14、-2細胞中α-SMA、TGF-β1的蛋白表達。
　　 （4）半定量RT-PCR法檢測HK-2細胞中α-SMA、TGF-β1的基因表達。
　　 結論：
　　 1.PTH可促進體外培養(yǎng)的腎小管上皮細胞發(fā)生凋亡，其作用可能通過調節(jié)凋亡相關基因Bax和Bcl-2的表達發(fā)揮作用。
　　 2.PTH可促進腎小管上皮細胞轉分化成肌成纖維細胞，促進TGF-β1的表達，因而在腎間質纖維化的發(fā)病機制中可能起著重要作用。