Gremlin在馬兜鈴酸誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中的作用研究.pdf

1、背景和目的：
　　 1993年比利時學(xué)者首次報道服用含馬兜鈴酸(aristolochic acid，AA)的中草藥導(dǎo)致進(jìn)行性腎小管間質(zhì)纖維化(renal tubulointerstitial fibrosis，RIF)，最終引起腎功能衰竭，后被稱為馬兜鈴酸腎病(aristolochic acid nephropathy，AAN)。研究表明AA主要導(dǎo)致腎小管間質(zhì)纖維化、慢性腎功能損傷和泌尿系統(tǒng)移行上皮腫瘤，其發(fā)病機(jī)制不是很清楚。我

2、們前期實驗研究發(fā)現(xiàn)骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(Bone morphogenetic protein-7，BMP-7)能有效的逆轉(zhuǎn)AA誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞(human renal tubular epithelial cells，HK-2)轉(zhuǎn)分化(epithelial-to-mesenchymal transition)，但BMP-7在AAN中調(diào)控機(jī)制仍不清楚。Gremlin，作為BMP-7拮抗劑，在AA誘導(dǎo)HK-2形成EMT中是否調(diào)節(jié)BMP-

3、7的腎損傷修復(fù)的作用尚不清楚。因此，進(jìn)一步揭示gremlin在AA誘導(dǎo)HK-2形成EMT中的作用，對探討AAN發(fā)病機(jī)制和制定新的防止措施具有重要意義。
　　 本課題通過建立AAN體外模型，觀察gremlin、BMP-7和P-Smad1/5/8的表達(dá)變化，探討gremlin是否調(diào)節(jié)BMP-7的腎臟保護(hù)作用，闡明gremlin在AAN中的作用機(jī)制，為AAN的防治尋找新的方向。
　　 方法：
　　 本課題分為2部分進(jìn)行

4、探討。
　　 第一部分：觀察AA誘導(dǎo)HK-2形成EMT時gremlin、BMP-7及其胞內(nèi)信號傳遞(P-Smad1/5/8水平)的表達(dá)。
　　 1、用MTT方法篩選出AA既能誘導(dǎo)EMT又不影響細(xì)胞活力的最適濃度。
　　 2、以此濃度作用HK-2細(xì)胞0h，24h，48h，72h，分別用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。用RT-PCR方法檢測gremlin、BMP-7 mRNA的表達(dá)，Western blot方法檢測

5、gremlin、BMP-7和P-Smad1/5/8蛋白水平。用免疫熒光染色檢測EMT相關(guān)標(biāo)記分子α-SMA和E-cadherin的表達(dá)。
　　 第二部分：Gremlin基因沉默對AA誘導(dǎo)的HK-2 EMT和BMP-7及其信號傳遞的影響
　　 1、根據(jù)人Gremlin mRNA基因編碼區(qū)序列，利用計算機(jī)軟件設(shè)計正對Gremlin的3對siRNA寡聚單鏈DNA，siRNAs(siRNA-Gremlin-1，si RNA-Gr

6、emlin-2，siRNA-Gremlin-3)，和一條作為陰性對照的無關(guān)序列(siRNA-Gremlin-neg)。將上述siRNA分別插入到siRNA表達(dá)載體pcDNATM6.2-GW/EmGFPsiR中，構(gòu)建3種特異性siRNA的質(zhì)粒(pshRNA-Gremlin-1，pshRNA-Gremlin-2，pshRNA-Gremlin-3)和1種表達(dá)無關(guān)序列的質(zhì)粒pshRNA-Gremlin-neg。
　　 2、分別以脂質(zhì)體L

7、ipofectamineTM2000為介導(dǎo)，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入HK-2細(xì)胞，用空白質(zhì)粒載體做為空白對照。實驗分組如下：1)正常對照組：細(xì)胞在DMEM/F12完全培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。2)AA組：細(xì)胞在含AA(10μmol/L)的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。3)：AA+Gremlin control siRNA：細(xì)胞轉(zhuǎn)染pshRNA-Gremlin-neg后培養(yǎng)于AA(10μmol/L)的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。4)：AA+Gremlin siRNA組：細(xì)胞轉(zhuǎn)染

8、pshRNA-Gremlin-3后培養(yǎng)于AA(10μmol/L)的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
　　 3、用倒置相差顯微鏡觀察各組細(xì)胞的形態(tài)，收集各組細(xì)胞RT-PCR檢測gremlin和BMP-7的mRNA水平，Western blot檢測gremlin、BMP-7、P-Smad1/5/8、α-SMA、E-cadherin和Ⅰ型膠原蛋白的蛋白水平，免疫熒光染色檢測EMT相關(guān)標(biāo)記分子α-SMA和E-cadherin的表達(dá)。
　　 結(jié)

9、果：
　　 第一部分：
　　 1、AA可誘導(dǎo)HK-2發(fā)生EMT，隨著AA誘導(dǎo)時間的延長細(xì)胞EMT形態(tài)變化越明顯。AA誘導(dǎo)EMT的最適濃度是10μmol/L。
　　 2、AA(10μmol/L)可增加HK-2α-SMA表達(dá)，減少E-cadherin表達(dá)，并呈時間依賴性。
　　 3、HK-2與(10μmol/L)AA孵育后，gremlin mRNA和蛋白水平24h即表現(xiàn)升高，72h達(dá)最高。同時，BMP-7和P

10、-Smad1/5/8表達(dá)水平逐漸下降，呈時間依賴性。
　　 第二部分：
　　 1：轉(zhuǎn)染gremlin siRNA能顯著抑制AA誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞的gremlin的表達(dá)，提高P-Smad1/5/8的蛋白水平，但BMP-7的表達(dá)水平無變化。
　　 2：轉(zhuǎn)染gremlin siRNA能顯著降低AA誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞的α-SMA和Ⅰ型膠原的表達(dá)，增加E-cadherin的表達(dá)，抑制EMT，促進(jìn)細(xì)胞的形態(tài)恢復(fù)。
　　

11、結(jié)論：
　　 1、AA可增加HK-2合成gremlin，減少BMP-7的表達(dá)和降低P-Smad1/5/8水平，提示gremlin/BMP-7失衡可能參與AA誘導(dǎo)的EMT。
　　 2、Gremlin基因沉默可顯著恢復(fù)P-Smad1/5/8水平，但對BMP-7表達(dá)無影響，說明gremlin高表達(dá)介導(dǎo)的BMP-7活性下降可能是AA誘導(dǎo)HK-2 EMT發(fā)生的機(jī)制之一。
　　 3、Gremlin基因沉默可顯著抑制EMT，促