非經(jīng)典型蛋白激酶C(ζ、τ)在尿蛋白誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中的作用.pdf

1、[目的]
　　探討在尿蛋白誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過程中非經(jīng)典型PKC同工酶(ζ、τ)所起的作用，明確哪些非經(jīng)典型PKC同工酶在腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中起關(guān)鍵作用，為臨床上防治尿蛋白所致慢性腎臟病尋找新靶點。
　　[方法]
　　1.應(yīng)用硫酸銨沉淀法提取局灶性節(jié)段性腎小球硬化癥腎病綜合癥患者尿液中的總蛋白，并分析其成分。
　　2.應(yīng)用不同濃度的尿蛋白(0 mg/ml、0.5 mg/ml1.0 mg/ml、2.0 m

2、g/ml、4.0mg/ml、8.0 mg/ml)處理體外培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察HK-2細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測HK-2細(xì)胞E-cadherin及α-SMA的表達(dá)。
　　3.實驗分正常組及尿蛋白刺激組，同步HK-2細(xì)胞24h后分別給予無血清培養(yǎng)基及尿蛋白(4.0 mg/ml)，共同培養(yǎng)48h，倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化;利用亞細(xì)胞組分提取試劑盒，提取細(xì)胞膜、細(xì)胞漿組分蛋白，Western Blott

3、ing法檢測各組細(xì)胞內(nèi)非經(jīng)典型PKC同工酶(ζ、τ)在細(xì)胞膜及細(xì)胞漿的活化易位情況。
　　4.應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察各組非經(jīng)典型PKC同工酶(ζ、τ)的活化易位情況。
　　[結(jié)果]
　　1.所提取尿蛋白的主要成分為白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和IgG等，分別占72.1％、17.9％和9.5％。
　　2.為確定其轉(zhuǎn)分化時的最適尿蛋白刺激濃度，首先使用不同濃度的尿蛋白(0 mg/ml、0.5 mg/ml、1.0 mg/ml、2

4、.0 mg/ml、4.0 mg/ml、8.0 mg/ml)刺激腎小管上皮細(xì)胞48h后，當(dāng)尿蛋白的濃度逐漸升高時，HK-2細(xì)胞隨之轉(zhuǎn)變?yōu)轭愃瞥衫w維細(xì)胞形態(tài)，E-cadherin表達(dá)下調(diào)，α-SMA表達(dá)上調(diào)，腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化特征最明顯的尿蛋白濃度為4.0 mg/ml。
　　3.尿蛋白誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)分化時，非經(jīng)典型PKC同工酶ζ、τ活化易位無明顯改變。
　　[結(jié)論]
　　非經(jīng)典型PKC同工酶ζ、τ在尿蛋白誘導(dǎo)的腎小