狼瘡腎炎患者尿蛋白刺激人近端腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的分子信號(hào)機(jī)制.pdf

1、腎間質(zhì)纖維化(tubulointerstitial fibrosis，TIF)是各種腎臟疾病進(jìn)展至腎功能衰竭的共同途徑，涉及腎臟固有細(xì)胞及炎性細(xì)胞的激活和功能異常等一系列病理生理過程，與細(xì)胞因子、生長因子、血管緊張素II、內(nèi)皮素、補(bǔ)體、蛋白分解酶、鐵、活性氧、磷以及梗阻相關(guān)因素等密切相關(guān)。近年的研究發(fā)現(xiàn)，蛋白尿在TIF的進(jìn)展中同樣具有重要作用，尿中超過正常范圍的蛋白既是腎臟疾病的標(biāo)志，也是腎間質(zhì)纖維化病情發(fā)展的最重要的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一

2、。 正常情況下終尿中的總蛋白含量不超過150mg／24小時(shí)，成分有：免疫球蛋白(IgG、IgA、IgM以及補(bǔ)體等)，白蛋白，微球蛋白(α、β)，THP，視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)，以及各種具有生物活性的酶等。其中白蛋白占40％，免疫球蛋白片段15％，其他血漿蛋白5％，腎和泌尿生殖系組織蛋白40％。在疾病情況下，尿中蛋白的含量增加，組成也發(fā)生顯著改變。這種尿蛋白含量和組成的改變勢必對腎臟固有細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，引起腎臟炎癥反應(yīng)及纖維化

3、的發(fā)生。目前的研究證實(shí)主要通過以下幾個(gè)途徑對腎小管間質(zhì)產(chǎn)生損傷作用：(1)大量蛋白通過濾過膜時(shí)對濾過膜本身造成機(jī)械損傷；(2)在腎小管內(nèi)形成管型阻塞腎小管可直接和間接降低GFR；(3)蛋白的重吸收過程具有競爭性，若一種小分子蛋白濾過增加，將影響其他蛋白重吸收，從而改變腎小管的正常功能；(4)腎小管蛋白負(fù)荷過重，細(xì)胞內(nèi)過多的蛋白激活多種細(xì)胞因子，啟動(dòng)了間質(zhì)炎癥反應(yīng)；(5)氮代謝產(chǎn)物氨、一氧化氮(NO)、補(bǔ)體、抗體和溶酶體酶也參與了間質(zhì)纖維

4、化；(6)通過上調(diào)血管緊張素原和ACE表達(dá)，下調(diào)腎素的基因表達(dá)使腎內(nèi)Ang Ⅱ生成增加；(7)激發(fā)腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生，引起氧化 應(yīng)激損傷?？诜Ｑ灏椎鞍字谱鞯牡鞍啄騽?dòng)物模型證實(shí)蛋白尿的程度與間質(zhì)炎癥及纖維化密切相關(guān)。腎小球來源的尿蛋白可通過多種途徑引起小管間質(zhì)損傷，其中誘導(dǎo)腎小管細(xì)胞分泌細(xì)胞因子及趨化物質(zhì)，引起間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤是蛋白尿引起腎小管損傷、間質(zhì)纖維化的重要途徑。許多學(xué)者在研究中發(fā)現(xiàn)白蛋白、IgG、轉(zhuǎn)鐵蛋白、脂蛋白、

5、補(bǔ)體等均可刺激或損傷腎小管細(xì)胞，引起腎小管細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子和生長因子(MIF、MCP-1、ET-1、RANTES、OPN、GM-CSF、IL-1、IL-6、IL-8、PDGF、TNF-α、TGF-β等)。 由于以往絕大多數(shù)體外試驗(yàn)都用血清白蛋白或純化白蛋白作為尿蛋白的代表進(jìn)行研究，而實(shí)際尿蛋白的組成很復(fù)雜，用單一的蛋白成分并不能完全代表體內(nèi)蛋白尿中多種成分的共同效應(yīng)。LN患者的尿蛋白成分非常復(fù)雜，其中包括有免疫球蛋白、白蛋白

6、、轉(zhuǎn)鐵蛋白、β2—微球蛋白、Tamm-Horsfall蛋白(THP)、視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)、溶菌酶等，提示LN患者的尿蛋白對小管間質(zhì)的損傷可能更嚴(yán)重。為進(jìn)一步明確系統(tǒng)性紅斑狼瘡腎炎(LN)患者尿蛋白對PTC的作用及其對腎間質(zhì)炎癥、纖維化的影響，我們提取了LN患者蛋白尿中的總蛋白成分，觀察其在刺激體外培養(yǎng)的人近端腎小管上皮細(xì)胞(PTC)轉(zhuǎn)分化過程中，是否有TGF-β／Smads信號(hào)通路的激活?如果有，使用TGF-β1中和抗體后，是否可

7、以阻斷尿蛋白誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化?是否還有其他的通路在起作用?通過本研究，以期為臨床預(yù)防和治療狼瘡腎炎纖維化的發(fā)生、發(fā)展提供新思路和理論依據(jù)。 本實(shí)驗(yàn)的目的在于： 1、探討狼瘡腎炎(LN)患者尿蛋白介導(dǎo)人近端腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)發(fā)生轉(zhuǎn)分化的分子信號(hào)機(jī)制。 2、使用TGF-β1中和抗體后，對尿蛋白誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響。 材料與方法 1、初發(fā)LN患者6例，男1例，女5例，平均年

8、齡27.4歲。均符合1982年美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)制定的SLE的診斷標(biāo)準(zhǔn)。所有患者的尿蛋白均>1g/d，并經(jīng)腎活檢證實(shí)為LN，臨床尚未開始腎上腺皮質(zhì)激素和(或)細(xì)胞毒藥物治療。 2、收集LN患者24小時(shí)尿液，提純尿蛋白，冰凍干燥，-20℃保存。 3、HK-2細(xì)胞用含10％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，鏡下觀察細(xì)胞長至融合度約80％-90％時(shí)換用無血清培養(yǎng)基同步24小時(shí)，隨機(jī)分為四組：A組細(xì)胞和1mg/ml尿蛋白共培養(yǎng)0、

9、1、3、6、12、24、48小時(shí),B組細(xì)胞和0、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、l0.Omg/ml尿蛋白共培養(yǎng)24小時(shí)，C組細(xì)胞在1mg/ml尿蛋白刺激前30min加入TGF-β1中和抗體(5μg/ml)，D組細(xì)胞為對照組，在1mg/ml尿蛋白刺激前30min加入和TGF-β1中和抗體相同來源(小鼠)的IgG對照(5μg/ml)。 4、收取細(xì)胞總RNA及蛋白進(jìn)行RT-PCR和Western印跡檢測TGF-β1、P-Sma

10、d2/3、α-SMA，間接免疫熒光檢測P-Smad2/3在細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)，ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TGF-β1的表達(dá)。 5、所有計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，根據(jù)方差齊性檢驗(yàn)結(jié)果組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。所有數(shù)據(jù)均用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01認(rèn)為差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 1、LN患者1mg/ml尿蛋白可刺激HK-2細(xì)胞上調(diào)TGF-β<,1>mRN

11、A、α-SMA、P-Smad2/3蛋白和mRNA的表達(dá)，并呈時(shí)間依賴性。 2、LN患者不同濃度的尿蛋白刺激HK-2細(xì)胞24小時(shí)可上調(diào)α-SMA、P-Smad2/3蛋白和mRNA的表達(dá)，并呈劑量依賴性。 3、與刺激前相比較，10mg/ml尿蛋白作用24小時(shí)后，可上調(diào)HK-2細(xì)胞P-Smad2/3核轉(zhuǎn)位。 4、ELISA檢測結(jié)果顯示，1mg/ml尿蛋白作用HK-2細(xì)胞0h、12h、24h、48h，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TG

12、F-β1表達(dá)逐漸增高，48h達(dá)高峰。 5、使用TGF-β1中和抗體可顯著抑制α-SMA、P-Smad2/3蛋白和mRNA的表達(dá)。 結(jié)論 綜上所述，本研究得出以下結(jié)論： 1、狼瘡腎炎患者尿蛋白刺激近端腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過程中有TGF-β／Smads信號(hào)系統(tǒng)的活化，并可誘導(dǎo)。腎小管細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化?；罨哪I小管上皮細(xì)胞可能轉(zhuǎn)化為肌成纖維母細(xì)胞，從而加重腎間質(zhì)纖維化。 2、使用TGF-βl中和抗體可顯