新型PKC同工酶在人近端腎小管上皮細(xì)胞的表達(dá)譜及尿蛋白對(duì)其表達(dá)的影響.pdf

1、目的：
　　 腎間質(zhì)纖維化是幾乎所有慢性腎臟疾病進(jìn)展到終末期腎功能衰竭的共同通路。腎小管-間質(zhì)的損害與腎功能毀損密切相關(guān)。作為構(gòu)成腎小管間質(zhì)結(jié)構(gòu)的主要細(xì)胞之一,腎小管上皮細(xì)胞不僅是疾病進(jìn)展中的受損者,而且是間質(zhì)炎癥、纖維化的積極參與者,在小管間質(zhì)病變進(jìn)展過(guò)程中起重要作用。眾所周知,包括尿蛋白在內(nèi)的多種致病因子對(duì)腎小管上皮細(xì)胞的損傷大多是通過(guò)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路介導(dǎo)的,而蛋白激酶C(PKC)是細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路中極其重要的環(huán)節(jié)之一。本

2、研究從細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路入手,通過(guò)檢測(cè)正常培養(yǎng)及受不同濃度尿蛋白刺激損傷的HK-2細(xì)胞新型蛋白激酶C同工酶(nPKCs)的表達(dá)譜,篩選出受尿蛋白刺激而損傷的HK-2細(xì)胞表達(dá)或上調(diào)表達(dá)的nPKCs,為進(jìn)一步明確其在此損傷過(guò)程中的作用,以及尋找一種可通過(guò)調(diào)節(jié)nPKCs表達(dá)和活化而延緩尿蛋白所致腎小管上皮細(xì)胞損傷的新的治療方法提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.應(yīng)用硫酸銨沉淀法提取原發(fā)性腎病綜合征(局灶節(jié)段性腎小球硬化型)患

3、者尿液中的總蛋白成分;
　　 2.以人近端腎小管上皮細(xì)胞株(HK-2細(xì)胞)作為研究對(duì)象;分別以不同濃度的尿蛋白(0 mg/ml,1 mg/ml,2 mg/ml,4 mg/ml,8mg/ml)處理體外培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞24h和48h;
　　 3.應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)(ICC)檢測(cè)正常對(duì)照及受不同濃度尿蛋白刺激后的HK-2細(xì)胞PKC-δ、PKC-η、PKC-θ、PKC-ε及PKC-μ表達(dá)情況;
　　 4.應(yīng)用SPSS

4、16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析。
　　 結(jié)果：
　　 1.所提取尿蛋白的主要成分為白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和IgG等,分別占72.1％、17.9%和9.5%,其它占0.5%;
　　 2.PKC-θ在正常對(duì)照組及尿蛋白刺激組HK-2細(xì)胞均表達(dá),表達(dá)部位主要在胞漿。ICC半定量分析結(jié)果顯示,尿蛋白刺激24h后,1mg/ml尿蛋白刺激組HK-2細(xì)胞PKC-θ表達(dá)量較正常對(duì)照組增高(P＜0.01),其余各組間差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

5、P＞0.05);尿蛋白刺激48h后,各濃度尿蛋白刺激組PKC-θ表達(dá)量較正常培養(yǎng)組明顯增高(P＜0.01):
　　 3.PKC-δ在正常對(duì)照組及尿蛋白刺激組HK-2細(xì)胞均表達(dá),表達(dá)部位主要在胞漿。ICC半定量分析結(jié)果顯示,尿蛋白刺激24h后,8mg/ml尿蛋白刺激組HK-2細(xì)胞PKC-δ表達(dá)量較1mg/ml,4mg/ml尿蛋白刺激組增高(P＜0.05),而其余各組間差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。尿蛋白刺激48h后,2 mg/

6、ml,4 mg/ml,8mg/ml尿蛋白刺激組PKC-δ的表達(dá)量較正常對(duì)照組增高(P＜0.01);
　　 4.PKC-ε在正常組及尿蛋白刺激組HK-2細(xì)胞胞漿廣泛表達(dá)。ICC半定量分析結(jié)果顯示,尿蛋白刺激24h和48h后,各尿蛋白刺激組與正常對(duì)照組PKC-ε表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);
　　 5.PKC-η在正常對(duì)照組及尿蛋白刺激組HK-2細(xì)胞均呈低水平表達(dá),表達(dá)部位主要在胞漿。ICC半定量分析結(jié)果顯示,尿蛋

7、白刺激24h和48h后,各尿蛋白刺激組與正常對(duì)照組PKC-η表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);
　　 6.PKC-μ在正常對(duì)照組及尿蛋白刺激組HK-2細(xì)胞均有表達(dá),表達(dá)部位主要在胞漿。ICC半定量分析結(jié)果顯示,尿蛋白刺激24h后,尿蛋白刺激組與正常培養(yǎng)組各組間PKC-μ表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。尿蛋白刺激48h后,各尿蛋白刺激組PKC-μ表達(dá)量較正常對(duì)照組增高(P＜0.01),而其余各濃度尿蛋白刺激組組間差別

8、無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 PKC同工酶δ、η、θ、ε、μ在正常對(duì)照及受不同濃度尿蛋白刺激而損傷的HK-2細(xì)胞均有表達(dá),表達(dá)情況有所不同。尿蛋白可明顯上調(diào)PKC-δ,μ,θ的表達(dá)。初步推測(cè)PKC-δ、PKC-μ、PKC-θ可能參與了尿蛋白所介導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷。因此,進(jìn)一步研究PKC-μ、KC-δ、PKC-θ參與尿蛋白介導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷的具體機(jī)制,對(duì)尋找一種干預(yù)其表達(dá)和活化而延緩尿蛋白所