蛋白激酶Cε在尿蛋白所致腎小管上皮細胞損傷中的作用.pdf

1、[目的]
　　 探討蛋白激酶Cε(PKC-s)在尿蛋白所致腎小管上皮細胞(RTECs)損傷中的作用，為防治尿蛋白所致腎間質(zhì)纖維化尋找治療新靶點。
　　 [方法]
　　 1.應(yīng)用硫酸銨沉淀法提取局灶性節(jié)段性腎小球硬化癥(focal segmentalglomerulosclerosis，F(xiàn)SGS)患者尿液中的總蛋白，并分析其成分。
　　 2.MTT法檢測終濃度為10μM，1μM，0.1μM的PKC-ε激動劑

2、和抑制劑體外培養(yǎng)HK-2細胞48小時后，檢測藥物對細胞活力的影響。
　　 3.應(yīng)用已提取FSGS患者來源的尿蛋白刺激HK-2細胞。實驗分組為空白組，蛋白刺激組(終濃度為4mg/ml)，PKC-ε激動劑組(終濃度為4mg/ml尿蛋白+10μM激動劑)及PKC-ε抑制劑組(終濃度為4mg/ml尿蛋白+10μM抑制劑)。激動劑組、抑制劑組分別給予濃度為10μM的PKC-ε特異性激動劑、抑制劑預孵育細胞30min后，加入尿蛋白使其終濃度

3、為4.0 mg/ml。培養(yǎng)細胞48h后，收集不同樣品進行相關(guān)檢測。
　　 4.利用亞細胞組分提取試劑盒，提取細胞膜、細胞漿組分蛋白。WesternBlotting法檢測藥物對細胞內(nèi)PKC-ε活化移位的影響。PKC-ε在胞膜/胞漿的比例上升則為活化移位增強，反之則為減弱。
　　 5.ELISA方法檢測各組細胞培養(yǎng)上清中人纖維連蛋白(FN)、致纖維化因子轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)的分泌水平。
　　 6.Wester

4、n blotting方法檢測各組a-SMA的表達，以Tubulin為內(nèi)參，反映各組細胞轉(zhuǎn)分化情況。
　　 7.通過全自動生化分析儀檢測各組細胞LDH釋放率，檢測細胞壞死情況。
　　 [結(jié)果]
　　 1.所提取尿蛋白的主要成分為白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和IgG等，分別占72.1％、17.9％和9.5％。
　　 2.終濃度為10μM，1μM，0.1μM的PKC-ε激動劑、抑制劑體外培養(yǎng)HK-2細胞48h時，藥物對細胞

5、活力無影響(P>0.05)。
　　 3.尿蛋白明顯抑制了PKC-ε的活化易位，激動劑組略微有所改善差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，抑制劑組則進一步抑制了PKC-ε的活化移位(P<0.05)。
　　 4.尿蛋白刺激下HK-2細胞α-SMA表達明顯上調(diào)，PKC-ε特異性激動劑對α-SMA表達無明顯影響，而抑制劑則使α-SMA表達量進一步上升。
　　 5.尿蛋白刺激HK-2細胞48h，能明顯增加細胞上清液中的FN和T

6、GF-β水平，激動劑組對FN的分泌未見明顯影響，并意外發(fā)現(xiàn)：激動劑能明顯下調(diào)TGF-β表達，抑制劑組較蛋白刺激組增加了FN、TGF-β的分泌水平(P<0.05)。
　　 6.尿蛋白組LDH釋放率明顯上升，激動劑組與尿蛋白組無明顯改善，抑制劑組LDH釋放率進一步上升。
　　 [結(jié)論]
　　 PKC-ε高活性是維持RTECs正常形態(tài)和功能的基礎(chǔ)，尿蛋白抑制RTECs正常PKC-ε高活性，減輕尿蛋白對PKC-ε活性的抑