蛋白激酶Cβ-,2-在不同血糖模式致人內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用.pdf

1、目的：研究蛋白激酶C(PKC)β2、PPARα在高糖誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)表達(dá)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血管細(xì)胞粘附分子1(VCAM-1)mRNA中的作用及相互關(guān)系。
　　方法：將培養(yǎng)的HUVECs分為以下8組:正常糖(NG，5 mmol/L D-葡萄糖)組、高糖（HG，25 mmol/L D-葡萄糖）組、滲透壓對(duì)照組(L，NG+20 mmol/L L-葡萄糖)組、正常糖空載體轉(zhuǎn)染(NN，NG+Ad5-null)

2、組、高糖PKCβ2轉(zhuǎn)染(HB，HG+Ad5-PKCβ2)組、高糖+非諾貝特組（HF，HG+40μmol/L非諾貝特）組、高糖PKCβ2轉(zhuǎn)染+非諾貝特(HBF，HB+40μmol/L非諾貝特)組，以上各組細(xì)胞均培養(yǎng)6天。另高糖孵育細(xì)胞6天后再與非諾貝特共培養(yǎng)20min作為HF20組。以RT-PCR檢測VEGF、VCAM-1 mRNA的表達(dá)水平，用Western印跡法測定PPARα蛋白表達(dá)，采用激光共聚焦檢測PKCβ2蛋白的表達(dá)和轉(zhuǎn)位。

3、r>　　結(jié)果：(1) HG組VEGF、VCAM-1 mRNA表達(dá)增加，分別為NG組的1.91倍和1.56倍（P值均＜0.05）;HG誘導(dǎo)PKCβ2核轉(zhuǎn)位激活，定量分析示HG組胞漿/胞核熒光強(qiáng)度比值較NG組降低37％(P＜0.05);HB組PKCβ2核轉(zhuǎn)位與HG組相比更加明顯，VEGF、VCAM-1 mRNA表達(dá)亦進(jìn)一步增加，分別為NG組的2.59倍和2.07倍（P值均＜0.05）。
　　(2) HG組PPARα蛋白表達(dá)較NG組減少

4、了20％(P＜0.05);與HG組相比，HF組PPARα蛋白水平上調(diào)了13％，VEGF、VCAM-1 mRNA表達(dá)則明顯下調(diào)，分別為HG組的68％和74％（P值均＜0.05）;與HG組相比，HF20組VEGF、VCAM-1 mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(3)HB組PPARα蛋白水平進(jìn)一步下降，為HG組的78％(P＜0.05)。
　　結(jié)論：高糖通過誘導(dǎo)HUVECs PKCβ2核轉(zhuǎn)位激活，進(jìn)而調(diào)控PPARα表達(dá)，增加VEGF、VCA

5、M-1 mRNA的表達(dá)。
　　第二部分蛋白激酶Cβ2-活性氧交互環(huán)介導(dǎo)高糖致人內(nèi)皮細(xì)胞損傷記憶效應(yīng)
　　目的：以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)作為體外模擬高血糖記憶的研究對(duì)象，觀察蛋白激酶C(PKC)β2、活性氧(ROS)對(duì)其表達(dá)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血管細(xì)胞粘附分子1(VCAM-1) mRNA的影響，并探討PKCβ2、ROS在其中可能的交互作用。
　　方法：將培養(yǎng)的HUVECs分為以下5組:正常糖(NG，5

6、 mmol/L D-葡萄糖×3周)組、高糖(HG，25 mmol/L D-葡萄糖×3周)組、記憶(M，25 mmol/L D-葡萄糖×2周+5 mmol/L D-葡萄糖×1周）組、記憶PKCβ2轉(zhuǎn)染(MB，25 mmol/L D-葡萄糖×2周+5 mmol/L D-葡萄糖×1周+Ad5-PKCβ2)組、記憶+α-硫辛酸（MA，25 mmol/L D-葡萄糖×2周+5mmol/L D-葡萄糖×1周+62.5μmol/Lα-硫辛酸）組。以R

7、T-PCR法檢測VEGF、VCAM-1 mRNA表達(dá)水平，用熒光顯微鏡和熒光酶標(biāo)儀測定ROS水平，采用激光共聚焦檢測PKCβ2蛋白的表達(dá)和轉(zhuǎn)位。
　　結(jié)果：(1) HG組和M組VEGF、VCAM-1 mRNA表達(dá)增加，分別為NG組的1.76倍、1.35倍和1.69倍、1.43倍（P值均＜0.05）。(2)HG組和M組ROS水平分別較NG組升高了86％、80％(P值均＜0.05);MA組ROS水平較M組下降了38％，同時(shí)MA組VEG

8、F、VCAM-1mRNA表達(dá)亦較M組顯著下調(diào)，分別為M組的67％、78％（P值均＜0.05）。(3) HG組和M組PKCβ2核轉(zhuǎn)位激活，定量分析顯示，胞漿/胞核熒光強(qiáng)度比值均較NG組下降，分別為NG組的70％、74％(P值均＜0.05);MB組PKCβ2核轉(zhuǎn)位較M組更為明顯，胞漿/胞核熒光強(qiáng)度比值為M組的77％，同時(shí)MB組VEGF、VCAM-1 mRNA表達(dá)亦較M組進(jìn)一步上調(diào)，分別為M組的1.29倍、1.18倍（P值均＜0.05）。(4

9、)MA組PKCβ2核轉(zhuǎn)位較M組減少，胞漿/胞核熒光強(qiáng)度比值為M組的1.18倍;而MB組ROS水平較M組上調(diào)了25％(P值均＜0.05)。
　　結(jié)論：HUVECs存在高糖記憶效應(yīng)，PKCβ2-ROS交互環(huán)可能介導(dǎo)了這個(gè)效應(yīng)的發(fā)生。
　　第三部分高糖波動(dòng)激活蛋白激酶Cβ2損傷人內(nèi)皮細(xì)胞及二甲雙胍的干預(yù)作用
　　目的：觀察波動(dòng)性高糖與持續(xù)性高糖對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血管細(xì)胞粘附分子1

10、(VCAM-1)mRNA表達(dá)及活性氧(ROS)水平的不同影響，探討PKCβ2在其中的作用及二甲雙胍(Metformin)的干預(yù)影響。
　　方法：將培養(yǎng)的HUVECs分為以下5組:正常糖（NG，5mmol/L D-葡萄糖）組、持續(xù)性高糖(SHG，15 mmol/L D-葡萄糖)組、波動(dòng)性高糖（IHG，5mmol/L D-葡萄糖與25mmol/L D-葡萄糖每24h更換一次）組、波動(dòng)性高糖PKCβ2轉(zhuǎn)染(IHGB，IHG+Ad5-PK

11、Cβ2)組、波動(dòng)性高糖+二甲雙胍（IHGM，IHG+20μmol/L二甲雙胍）組。以上各組細(xì)胞均培養(yǎng)14天。以RT-PCR法檢測細(xì)胞VEGF、VCAM-1 mRNA表達(dá)水平，用熒光酶標(biāo)儀測定細(xì)胞ROS水平，采用激光共聚焦檢測PKCβ2蛋白表達(dá)和轉(zhuǎn)位。
　　結(jié)果：(1) IHG組和SHG組VEGF、VCAM-1 mRNA表達(dá)及ROS水平增加，分別為NG組的1.29倍、2.32倍、3.21倍和1.17倍、1.63倍、1.75倍，且IH

12、G組增加更明顯（P值均＜0.05）。(2) IHG組和SHG組PKCβ2核轉(zhuǎn)位激活，定量分析顯示胞漿/胞核熒光強(qiáng)度比值較NG組分別下降了21％和26％，且IHG組下降更加明顯（P值均＜0.05）;IHGB組PKCβ2核轉(zhuǎn)位較IHG組更顯著，胞漿/胞核熒光強(qiáng)度比值為IHG組的75％，同時(shí)IHGB組VEGF、VCAM-1mRNA表達(dá)以及ROS水平亦顯著高，分別為IHG組的1.16倍、1.26倍和1.25倍（P值均＜0.05）。(3) IHG