經(jīng)典型PKC同工酶的尿蛋白誘導(dǎo)在腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化中的作用.pdf

1、目的：
　　 明確經(jīng)典型PKC同工酶是否參與尿蛋白誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化,那一種或幾種經(jīng)典型PKC同工酶在腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化中起關(guān)鍵作用,探討其有效的阻斷途徑,為尿蛋白所致慢性腎臟病的防治尋找新的靶點。
　　 方法：
　　 1.應(yīng)用硫酸銨沉淀法提取局灶性節(jié)段性腎小球硬化癥腎綜患者尿液中的總蛋白成分。
　　 2.應(yīng)用不同濃度的尿蛋白(0 mg/ml、1.0 mg/ml、2.0 mg/ml、4.0 mg

2、/ml、8.0 mg/ml)處理體外培養(yǎng)的HK-2細胞,倒置顯微鏡下觀察HK-2細胞形態(tài)改變,運用免疫細胞化學(xué)(ICC)法檢測HK-2細胞E-cadherin及α-SMA的表達,確定使HK-2細胞轉(zhuǎn)分化時的最適尿蛋白刺激濃度(4.0 mg/ml)。
　　 3.分別給予經(jīng)典型PKC同工酶抑制劑G(o)6976和PKC-β inhibitor預(yù)孵育細胞30min后,加入尿蛋白使其終濃度為4.0 mg/ml共同培養(yǎng)48h,倒置顯微鏡下

3、觀察各組細胞形態(tài)變化;采用Western blotting方法檢測各組經(jīng)典型PKC同工酶(α、βⅠ、βⅡ)的活化易位情況;采用Western blotting方法檢測各組E-cadherin、α-SMA的表達;采用ELISA方法檢測各組細胞培養(yǎng)上清中Ⅰ型膠原、FN的分泌水平。
　　 結(jié)果：
　　 1.所提取的尿蛋白的主要成分為白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和IgG等,分別占72.1％、17.9%和9.5%。
　　 2.不同濃度

4、的尿蛋白(0 mg/ml、1.0 mg/ml、2.0 mg/ml、4.0 mg/ml、8.0 mg/ml)刺激腎小管上皮細胞48h后,隨著尿蛋白的濃度升高,HK-2細胞逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)轭愃瞥衫w維細胞形態(tài),E-cadherin表達下調(diào),α-SMA表達上調(diào),尿蛋白濃度為4.0 mg/ml時,腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化特征最明顯。
　　 3.尿蛋白誘導(dǎo)的HK-2細胞轉(zhuǎn)分化時,經(jīng)典型PKC同工酶α、βⅠ活化易位明顯,βⅡ無明顯變化。
　　

5、4.經(jīng)典型PKC同工酶抑制劑G(o)6976和PKC-β inhibitor可使尿蛋白誘導(dǎo)轉(zhuǎn)分化的HK-2細胞E-cadherin表達增多,α-SMA表達減少,分泌I型膠原、FN減少。
　　 結(jié)論：
　　 兩種經(jīng)典型PKC同工酶α、βⅠ在尿蛋白誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化中發(fā)揮一定的作用,尿蛋白誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化可能部分是通過活化經(jīng)典型PKC同工酶α、βⅠ實現(xiàn)的。因此,特異性抑制經(jīng)典型PKC同工酶α、βⅠ可能能阻止