溫莪術(shù)對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的干預(yù)作用.pdf

1、目的:本研究在體外建立大鼠腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(Epithelial-myofibroblasttransdifferentiation)模型，通過檢測(cè)細(xì)胞骨架蛋白β-actin，上皮細(xì)胞黏附分子E-cad，纖維化標(biāo)志α-SMA、ILK、FN、Col-Ⅰ等蛋白及基因的表達(dá)，探討溫莪術(shù)對(duì)EMT的干預(yù)作用及可能的作用機(jī)制。
　　 方法:通過MTT法選取合適的溫莪術(shù)含藥血清給藥濃度后，將體外培養(yǎng)的正常大鼠腎小管上皮細(xì)胞(NRK-52E

2、)隨機(jī)分為6組:正常對(duì)照組、TGF-β1誘導(dǎo)模型組、溫莪術(shù)低濃度組、溫莪術(shù)中濃度組、溫莪術(shù)高濃度組、鹽酸貝那普利組，其中溫莪術(shù)及鹽酸貝那普利均以體外制作的含藥血清方式給藥。除正常對(duì)照組外，各組轉(zhuǎn)化生長因子-β1(Transforming growth factor-β1，TGF-β1)以10ng/mL的濃度誘導(dǎo)24 h后，溫莪術(shù)組及鹽酸貝那普利組再加入藥物作用48 h。運(yùn)用倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變，細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)各組細(xì)胞漿

3、內(nèi)骨架成分β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)，纖維化標(biāo)志物α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smoothmuscle actin，α-SMA)的分布;用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)上皮細(xì)胞黏附分子E鈣黏蛋白(E-cadherin，E-cad) mRNA、及細(xì)胞內(nèi)α-SMA、整合素連接激酶(Integrin-linked kinase，ILK)、纖維黏連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)、Ⅰ型膠原蛋白(CollagenⅠ，Col-Ⅰ)的mRNA的表達(dá);用

4、ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中FN及Col-Ⅰ蛋白的分泌量。
　　 結(jié)果:
　　 (1) MTT法選取的合適藥物濃度:10％、20％、30％溫莪術(shù)含藥血清組吸光度值較模型組出現(xiàn)升高的趨勢(shì)(P＜0.05)，但是較之20％溫莪術(shù)含藥血清組，30％溫莪術(shù)含藥血清組吸光值有所下降，故選用20％溫莪術(shù)含藥血清做為高劑量組，10％溫莪術(shù)含藥血清做為中劑量組，5％溫莪術(shù)含藥血清做為低劑量組。
　　 (2)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變:正常

5、組細(xì)胞形態(tài)為鋪路石樣，為典型的上皮細(xì)胞樣形態(tài)，而模型組細(xì)胞出現(xiàn)肥大拉長，呈梭形，溫莪術(shù)各濃度組細(xì)胞形態(tài)較模型組改善，成纖維細(xì)胞樣改變的數(shù)量減少。
　　 (3)溫莪術(shù)對(duì)細(xì)胞骨架蛋白β-actin的影響:與正常組細(xì)胞比較，模型組細(xì)胞可見束狀纖維樣結(jié)構(gòu)呈放射狀排列，相互交叉成網(wǎng)狀，溫莪術(shù)給藥組細(xì)胞可見明顯減少，β-actin表達(dá)量降低(P＜0.05)，溫莪術(shù)中濃度組與鹽酸洛汀新組作用相似。
　　 (4)溫莪術(shù)對(duì)α-SMA蛋白及

6、mRNA表達(dá)的影響:正常組細(xì)胞幾乎沒有α-SMA蛋白及mRNA的表達(dá)，而模型組α-SMA的表達(dá)明顯升高(P＜0.05)，胞漿內(nèi)可見大量熒光染色陽性，α-SMAm RNA表達(dá)增多;和模型組比較，溫莪術(shù)組細(xì)胞可見α-SMA蛋白及mRNA表達(dá)顯著減少(P＜0.05)，溫莪術(shù)中濃度組與鹽酸洛汀新組相似，溫莪術(shù)組與鹽酸洛汀新組作用相似。
　　 (5)溫莪術(shù)對(duì)E-cadherin mRNA表達(dá)的影響:與正常對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞E-cadh

7、erin mRNA的表達(dá)量顯著減少(P＜0.05)，而溫莪術(shù)給藥組E-cadherinmRNA的表達(dá)則較模型組增多(P＜0.05)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，溫莪術(shù)高濃度組與鹽酸洛汀新組作用相似。
　　 (6)溫莪術(shù)對(duì)ILK mRNA表達(dá)的影響:與正常對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞ILKmRNA的表達(dá)量顯著減少(P＜0.05)，而溫莪術(shù)給藥組ILK mRNA的表達(dá)則較模型組增多(P＜0.05)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，溫莪術(shù)高濃度組與鹽酸洛汀新組作用相似

8、。
　　 (7)溫莪術(shù)對(duì)細(xì)胞外FN蛋白分泌及細(xì)胞內(nèi)FN mRNA表達(dá)的影響:與正常對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞FN蛋白分泌及FN mRNA表達(dá)顯著減少(P＜0.05)，而溫莪術(shù)給藥組FN蛋白分泌及FN mRNA表達(dá)則較模型組增多(P＜0.05)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，溫莪術(shù)組與鹽酸洛汀新組作用相似。
　　 (8)溫莪術(shù)對(duì)細(xì)胞外Col-Ⅰ蛋白分泌及細(xì)胞內(nèi)Col-Ⅰ mRNA表達(dá)的影響:與正常對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞Col-Ⅰ蛋白分泌及C

9、ol-Ⅰ mRNA表達(dá)顯著減少(P＜0.05)，而溫莪術(shù)給藥組Col-Ⅰ蛋白分泌及Col-ⅠmRNA表達(dá)則較模型組增多(P＜0.05)，溫莪術(shù)高濃度組與鹽酸洛汀新組作用相似。
　　 結(jié)論:
　　 1、10ng/mL TGF-β1成功建立體外大鼠腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化細(xì)胞模型;
　　 2、在腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的模型中，細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)β-actin分布改變，胞漿中可見束狀纖維樣結(jié)構(gòu)呈放射狀排列，上皮細(xì)胞標(biāo)志E-cadh

10、erin的表達(dá)下降，纖維化相關(guān)蛋白α-SMA、ILK表達(dá)上升，細(xì)胞外基質(zhì)FN、Col-Ⅰ分泌增多，NRK-52E發(fā)生成纖維樣改變。
　　 3、溫莪術(shù)可在一定程度內(nèi)抑制腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的發(fā)生，較之模型組細(xì)胞，溫莪術(shù)給藥組細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)β-actin在胞漿中的束狀纖維樣結(jié)構(gòu)減少，上皮細(xì)胞標(biāo)志E-cadherin的表達(dá)增多，纖維化相關(guān)蛋白α-SMA、ILK表達(dá)下降，細(xì)胞外基質(zhì)FN、Col-Ⅰ分泌減少，這也可能是溫莪術(shù)發(fā)揮作用的主要機(jī)