Brachyury在TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化中的作用及機制研究.pdf

1、【背景】
　　各種進展型腎臟疾病,無論其原發(fā)病如何,最終都將導(dǎo)致腎纖維化,進而進展為終末期腎功能衰竭,嚴重影響了人類的健康。我國是慢性腎臟病大國,慢性腎臟病患者約有1.1億,約占我國全部人口的10.8％,且目前仍有增高趨勢,腎病已經(jīng)成為當今威脅中國人口健康的主要疾病之一,數(shù)量巨大的慢性腎病患者的存在,給國家經(jīng)濟帶來了沉重的負擔。因此,研究腎間質(zhì)纖維化的發(fā)病機制、尋找能夠緩解或逆轉(zhuǎn)腎間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵靶點、延緩終末期腎衰的發(fā)生已經(jīng)成為

2、目前腎臟疾病研究領(lǐng)域的熱點。
　　多種腎臟損傷因素可引起腎臟纖維化,其主要的病理表現(xiàn)為細胞外基質(zhì)沉積和腎小管上皮細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)。EMT是指受到外界各種病理因素刺激的上皮細胞,因失去了維持細胞之間生理功能的細胞因子間的相互作用,使其維持上皮細胞形態(tài)的基因表達受到抑制,獲得間皮細胞形態(tài)的基因得到釋放,上皮細胞基底膜遭到破壞,上皮細胞失去其原有表型獲得

3、間充質(zhì)表型特征。在腎小管EMT過程中,細胞之間起黏附作用分子表達減少,如E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、緊密連接蛋白(zonula occludentes protein,ZO-1);而間充質(zhì)標識物表達增多,如波形蛋白(vimentin)、α平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)等。EMT在胚胎的發(fā)育,腫瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移以及器官纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中均發(fā)揮著重要的作用。
　　進化幾近保守的T

4、-box轉(zhuǎn)錄因子家族成員Brachyury在脊椎動物中胚層的發(fā)育中,尤其是脊索的發(fā)育過程中扮演了重要的角色。近年研究表明Brachyury誘導(dǎo)了腫瘤細胞轉(zhuǎn)分化發(fā)生,在轉(zhuǎn)錄水平上,上調(diào)鋅指家族Slug的表達,從而抑制E-cadherin的轉(zhuǎn)錄,進而促進了腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。E-cadherin作為轉(zhuǎn)分化的經(jīng)典上皮分子標志物,介導(dǎo)了細胞之間的粘附作用,其表達的抑制在腫瘤細胞的分化、侵襲和轉(zhuǎn)移及器官纖維化過程中發(fā)揮了重要作用。TGF-β1

5、作為公認的致腎臟纖維化細胞因子,其參與腎小管EMT進而促進腎臟纖維化的具體分子機制仍未完全闡明。目前已研究發(fā)現(xiàn)在非洲爪蟾胚胎發(fā)育過程中Brachyury受TGF-β超家族調(diào)控。但是到目前為止尚未有報道證實Brachyury在TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管EMT中的作用。
　　【目的】
　　探討B(tài)rachyury在TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管EMT中的作用及其分子機制,進一步為闡明TGF-β1導(dǎo)致腎臟纖維化的分子機制提供新的視角,為尋找

6、新的逆轉(zhuǎn)腎臟纖維化的治療策略提供理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。
　　【方法】
　　1.通過qRT-PCR與WB檢測TGF-β1干預(yù)不同時間,不同濃度的TGF-β1干預(yù)的腎小管上皮細胞(HK2)中Brachyury的表達;
　　2.通過細胞轉(zhuǎn)染,分別上調(diào)和下調(diào)HK2細胞中Brachyury的表達,通過免疫熒光檢測Brachyury對HK2細胞表型的影響;
　　3.通過WB檢測Brachyury對HK2細胞EMT相關(guān)蛋白水平的

7、影響;
　　4.通過細胞轉(zhuǎn)染,上調(diào)HK2細胞中Brachyury的表達,觀察其下游靶基因Snail和Slug的表達;
　　5.通過細胞轉(zhuǎn)染,分別下調(diào)HK2細胞中Snail和Slug的表達,Westernblot檢測Brachyury-Snail-Slug通路對EMT的影響;
　　6.構(gòu)建單側(cè)輸尿管結(jié)扎模型(UUO),免疫組化檢測Brachyury、表皮細胞及肌成纖維細胞標志分子的表達,在蛋白水平檢測Brachyury的

8、表達;
　　7.收集IgA腎病(LeeⅢ-Ⅴ)患者病理標本,免疫組化檢測TGF-β1,Brachyury及其下游靶基因在纖維化腎臟組織中的表達,并分析Brachyury與腎小管間質(zhì)纖維化之間的關(guān)系。
　　【結(jié)果】
　　1.實時熒光定量PCR實驗與蛋白印記實驗結(jié)果顯示,不同TGF-β1濃度刺激HK2細胞,1ng/mlTGF-β1時Brachyury表達升高,5ng/ml時表達最高,10ng/ml時仍持續(xù)高表達;5ng/m

9、lTGF-β1不同時間點刺激HK2細胞,結(jié)果顯示,2h時mRNA表達升高,在12h表達最高,持續(xù)至24h,其蛋白表達基本與轉(zhuǎn)錄水平表達一致;
　　2.免疫熒光實驗結(jié)果顯示:與對照組相比,Brachyury正義質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后HK2細胞其上皮標志分子E-cadherin與Plakoglobin表達減少,而間皮標志物vimentin表達增強;
　　3.WB實驗結(jié)果證實了免疫熒光的結(jié)果;下調(diào)Brachyury表達后可部分逆轉(zhuǎn)由TGF-β

10、1誘導(dǎo)的EMT;
　　4.與對照細胞相比,轉(zhuǎn)染Brachyury正義質(zhì)粒的HK2細胞中Snail和Slug在蛋白水與mRNA水平上的表達均升高;
　　5.與對照細胞相比,分別轉(zhuǎn)染了Snail和Slug的siRNA后,可以分別部分逆轉(zhuǎn)由TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管EMT和Brachyury誘導(dǎo)的腎小管EMT;
　　6.免疫組化結(jié)果顯示,E-cadherin的表達與UUO的時間成負相關(guān),而vimentin的表達與UUO時間成正

11、相關(guān),Brachyury在UUO3天時表達升高,7天時表達最高;WB驗證了免疫組化的結(jié)果;
　　7.收集43例LeeⅢ-Ⅴ級IgA腎病患者臨床標本,免疫組化實驗顯示,和正常腎臟組織相比,IgA腎病患者TGF-β1,Brachyury及其下游靶分子表達升高,且與E-cadherin成負相關(guān);
　　8.在纖維化腎臟組織中,Brachyury的表達與腎小管間質(zhì)纖維化成正相關(guān)。
　　【結(jié)論】
　　1.Brachyury的

12、表達與TGF-β1成時間和劑量的依賴性,即Brachyury在TGF-β1刺激后被激活,可能參與了TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管轉(zhuǎn)分化和腎臟纖維化;
　　2.上調(diào)或者下調(diào)Brachyury的表達,結(jié)果顯示Brachyury參與了TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管轉(zhuǎn)分化和腎臟纖維化,并可以部分逆轉(zhuǎn)由TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管轉(zhuǎn)分化;
　　3.Brachyury通過其下游靶基因Snail及Slug參與了EMT過程,下調(diào)Snail及Slug的表達可