Brachyury在TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、【背景】
　　各種進(jìn)展型腎臟疾病,無(wú)論其原發(fā)病如何,最終都將導(dǎo)致腎纖維化,進(jìn)而進(jìn)展為終末期腎功能衰竭,嚴(yán)重影響了人類的健康。我國(guó)是慢性腎臟病大國(guó),慢性腎臟病患者約有1.1億,約占我國(guó)全部人口的10.8％,且目前仍有增高趨勢(shì),腎病已經(jīng)成為當(dāng)今威脅中國(guó)人口健康的主要疾病之一,數(shù)量巨大的慢性腎病患者的存在,給國(guó)家經(jīng)濟(jì)帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。因此,研究腎間質(zhì)纖維化的發(fā)病機(jī)制、尋找能夠緩解或逆轉(zhuǎn)腎間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵靶點(diǎn)、延緩終末期腎衰的發(fā)生已經(jīng)成為

2、目前腎臟疾病研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。
　　多種腎臟損傷因素可引起腎臟纖維化,其主要的病理表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)沉積和腎小管上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)。EMT是指受到外界各種病理因素刺激的上皮細(xì)胞,因失去了維持細(xì)胞之間生理功能的細(xì)胞因子間的相互作用,使其維持上皮細(xì)胞形態(tài)的基因表達(dá)受到抑制,獲得間皮細(xì)胞形態(tài)的基因得到釋放,上皮細(xì)胞基底膜遭到破壞,上皮細(xì)胞失去其原有表型獲得

3、間充質(zhì)表型特征。在腎小管EMT過(guò)程中,細(xì)胞之間起黏附作用分子表達(dá)減少,如E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、緊密連接蛋白(zonula occludentes protein,ZO-1);而間充質(zhì)標(biāo)識(shí)物表達(dá)增多,如波形蛋白(vimentin)、α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)等。EMT在胚胎的發(fā)育,腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移以及器官纖維化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中均發(fā)揮著重要的作用。
　　進(jìn)化幾近保守的T

4、-box轉(zhuǎn)錄因子家族成員Brachyury在脊椎動(dòng)物中胚層的發(fā)育中,尤其是脊索的發(fā)育過(guò)程中扮演了重要的角色。近年研究表明Brachyury誘導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)分化發(fā)生,在轉(zhuǎn)錄水平上,上調(diào)鋅指家族Slug的表達(dá),從而抑制E-cadherin的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。E-cadherin作為轉(zhuǎn)分化的經(jīng)典上皮分子標(biāo)志物,介導(dǎo)了細(xì)胞之間的粘附作用,其表達(dá)的抑制在腫瘤細(xì)胞的分化、侵襲和轉(zhuǎn)移及器官纖維化過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。TGF-β1

5、作為公認(rèn)的致腎臟纖維化細(xì)胞因子,其參與腎小管EMT進(jìn)而促進(jìn)腎臟纖維化的具體分子機(jī)制仍未完全闡明。目前已研究發(fā)現(xiàn)在非洲爪蟾胚胎發(fā)育過(guò)程中Brachyury受TGF-β超家族調(diào)控。但是到目前為止尚未有報(bào)道證實(shí)Brachyury在TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管EMT中的作用。
　　【目的】
　　探討B(tài)rachyury在TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管EMT中的作用及其分子機(jī)制,進(jìn)一步為闡明TGF-β1導(dǎo)致腎臟纖維化的分子機(jī)制提供新的視角,為尋找

6、新的逆轉(zhuǎn)腎臟纖維化的治療策略提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　【方法】
　　1.通過(guò)qRT-PCR與WB檢測(cè)TGF-β1干預(yù)不同時(shí)間,不同濃度的TGF-β1干預(yù)的腎小管上皮細(xì)胞(HK2)中Brachyury的表達(dá);
　　2.通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染,分別上調(diào)和下調(diào)HK2細(xì)胞中Brachyury的表達(dá),通過(guò)免疫熒光檢測(cè)Brachyury對(duì)HK2細(xì)胞表型的影響;
　　3.通過(guò)WB檢測(cè)Brachyury對(duì)HK2細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白水平的

7、影響;
　　4.通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染,上調(diào)HK2細(xì)胞中Brachyury的表達(dá),觀察其下游靶基因Snail和Slug的表達(dá);
　　5.通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染,分別下調(diào)HK2細(xì)胞中Snail和Slug的表達(dá),Westernblot檢測(cè)Brachyury-Snail-Slug通路對(duì)EMT的影響;
　　6.構(gòu)建單側(cè)輸尿管結(jié)扎模型(UUO),免疫組化檢測(cè)Brachyury、表皮細(xì)胞及肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志分子的表達(dá),在蛋白水平檢測(cè)Brachyury的

8、表達(dá);
　　7.收集IgA腎病(LeeⅢ-Ⅴ)患者病理標(biāo)本,免疫組化檢測(cè)TGF-β1,Brachyury及其下游靶基因在纖維化腎臟組織中的表達(dá),并分析Brachyury與腎小管間質(zhì)纖維化之間的關(guān)系。
　　【結(jié)果】
　　1.實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)與蛋白印記實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,不同TGF-β1濃度刺激HK2細(xì)胞,1ng/mlTGF-β1時(shí)Brachyury表達(dá)升高,5ng/ml時(shí)表達(dá)最高,10ng/ml時(shí)仍持續(xù)高表達(dá);5ng/m

9、lTGF-β1不同時(shí)間點(diǎn)刺激HK2細(xì)胞,結(jié)果顯示,2h時(shí)mRNA表達(dá)升高,在12h表達(dá)最高,持續(xù)至24h,其蛋白表達(dá)基本與轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)一致;
　　2.免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,Brachyury正義質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后HK2細(xì)胞其上皮標(biāo)志分子E-cadherin與Plakoglobin表達(dá)減少,而間皮標(biāo)志物vimentin表達(dá)增強(qiáng);
　　3.WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了免疫熒光的結(jié)果;下調(diào)Brachyury表達(dá)后可部分逆轉(zhuǎn)由TGF-β

10、1誘導(dǎo)的EMT;
　　4.與對(duì)照細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)染Brachyury正義質(zhì)粒的HK2細(xì)胞中Snail和Slug在蛋白水與mRNA水平上的表達(dá)均升高;
　　5.與對(duì)照細(xì)胞相比,分別轉(zhuǎn)染了Snail和Slug的siRNA后,可以分別部分逆轉(zhuǎn)由TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管EMT和Brachyury誘導(dǎo)的腎小管EMT;
　　6.免疫組化結(jié)果顯示,E-cadherin的表達(dá)與UUO的時(shí)間成負(fù)相關(guān),而vimentin的表達(dá)與UUO時(shí)間成正

11、相關(guān),Brachyury在UUO3天時(shí)表達(dá)升高,7天時(shí)表達(dá)最高;WB驗(yàn)證了免疫組化的結(jié)果;
　　7.收集43例LeeⅢ-Ⅴ級(jí)IgA腎病患者臨床標(biāo)本,免疫組化實(shí)驗(yàn)顯示,和正常腎臟組織相比,IgA腎病患者TGF-β1,Brachyury及其下游靶分子表達(dá)升高,且與E-cadherin成負(fù)相關(guān);
　　8.在纖維化腎臟組織中,Brachyury的表達(dá)與腎小管間質(zhì)纖維化成正相關(guān)。
　　【結(jié)論】
　　1.Brachyury的

12、表達(dá)與TGF-β1成時(shí)間和劑量的依賴性,即Brachyury在TGF-β1刺激后被激活,可能參與了TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管轉(zhuǎn)分化和腎臟纖維化;
　　2.上調(diào)或者下調(diào)Brachyury的表達(dá),結(jié)果顯示Brachyury參與了TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管轉(zhuǎn)分化和腎臟纖維化,并可以部分逆轉(zhuǎn)由TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管轉(zhuǎn)分化;
　　3.Brachyury通過(guò)其下游靶基因Snail及Slug參與了EMT過(guò)程,下調(diào)Snail及Slug的表達(dá)可