TGF-β1-smads通路調(diào)控COPD發(fā)病過程中氣道上皮細胞分泌SLPI的作用機制研究.pdf

1、慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一組嚴重危害人群健康的常見疾病，近年來，其發(fā)病率在全球均有明顯上升趨勢。COPD發(fā)病機制尚未完全闡明，目前多數(shù)學(xué)者認為彈性蛋白酶一抗蛋白酶失衡是COPD發(fā)生、發(fā)展的重要機制之一。研究表明，慢性支氣管炎患者(無論急性發(fā)作與否)其氣道腔內(nèi)中性粒細胞百分數(shù)顯著高于對照組。同時發(fā)現(xiàn)，慢支患者的氣流阻塞程度與支氣管灌洗液中中性粒細胞數(shù)量增多有關(guān)。以上研究表明，COPD患者氣道腔內(nèi)存在中性粒細胞的聚集狀態(tài)，中性粒細胞彈

2、力酶(NE)是中性粒細胞釋放的絲氨酸蛋白酶，被認為是肺炎性損傷級聯(lián)反應(yīng)的主要終效應(yīng)因子，其對肺組織結(jié)構(gòu)蛋白有直接損傷作用，是肺氣腫形成過程中的關(guān)鍵作用環(huán)節(jié)。中性粒細胞聚集導(dǎo)致彈性蛋白酶負荷的增加，從而促進了COPD的發(fā)生發(fā)展。與蛋白酶相對應(yīng)，體內(nèi)的抗蛋白酶主要有：1.α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)，這是肺實質(zhì)中主要的抗蛋白酶，它由肝臟合成，血漿轉(zhuǎn)運。α1-AT主要對抗中性粒細胞彈性蛋白酶。2.α1-抗糜蛋白酶。3.組織金屬蛋白酶抑制物(

3、TIMPs)。該酶主要對抗MMPs。4.分泌性白細胞蛋白酶抑制物(SLPI)，這是氣道中最重要的保護基質(zhì)，它起源于氣道上皮細胞，在氣道中可起到局部防護作用。國內(nèi)外研究最多、最透徹的是α1-AT它是人血漿中最主要的抗蛋白酶，但其并不能完成在肺間質(zhì)中的保護作用；相對而言，目前國內(nèi)外對源于氣道上皮細胞在氣道中起到局部最重要防護作用的SLPI的研究卻較少，SLPI能夠抑制金屬蛋白酶的產(chǎn)生，抑制核因子-kB(NF-kB)的活性和減輕炎癥反應(yīng)。SL

4、PI還可以抑制氣道上皮細胞中性粒細胞彈性蛋白酶(NE)的水平和白細胞介素8(IL-8)的水平，從而可以中斷炎癥循環(huán)，提示SLPI可能是氣道中最重要的保護基質(zhì)之一。 轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)也被認為是COPD發(fā)病機制中的關(guān)鍵致病因子，其作用機制可能與肺纖維化的形成及氣道重構(gòu)密切關(guān)聯(lián)。已有研究證實，TGF-β受體激活后，由TGF-βI型受體到核內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)主要由Smads蛋白家族的胞漿蛋白磷酸化完成的。被激活的已經(jīng)磷酸化的S

5、mad2和Smad3只有與Smad4結(jié)合形成復(fù)合物，才能使TGF-β1信號傳導(dǎo)進入細胞核，從而起到生物學(xué)效應(yīng)。然而，在COPD發(fā)病過程中，SLPI在支氣管肺組織中的如何表達及其是否與TGF-β1存在對應(yīng)關(guān)系尚不清楚，若二者存在對應(yīng)關(guān)系，Smads信號通路是否在此過程中起作用作用。本研究對此進行了探討。 第一部分：分泌性白細胞蛋白酶抑制物在慢性阻塞性肺疾病大鼠支氣管肺組織中的表達及轉(zhuǎn)化生長因子β1對其影響的研究 采用熏香煙

6、加氣管內(nèi)注射內(nèi)脂多糖復(fù)制大鼠COPD模型，并用TGF-β1單抗干預(yù)，測定大鼠的肺功能及病理變化結(jié)果，應(yīng)用酶聯(lián)免疫法檢測支氣管肺泡灌洗液(BALF)中SLPI的水平，用免疫組織化學(xué)法觀察TGF-β1、Smad4、SLPI在支氣管肺組織中的表達情況，用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈法檢測TGF-β1、Smad4和SLPImRNA在支氣管肺組織中的表達水平。 結(jié)果顯示：光鏡下可見模型組支氣管上皮細胞變性壞死脫落，大量炎癥細胞浸潤，肺大皰形成，氣管及血

7、管壁增厚，管腔狹窄閉塞。干預(yù)組可見少量支氣管上皮細胞變性壞死脫落，氣管及血管壁輕度增厚，少量炎性細胞浸潤，管壁未見明顯增厚，未見明顯肺大皰的形成及管腔狹窄。而正常對照組未見異常。模型組大鼠比對照組大鼠的肺功能明顯降低，干預(yù)組大鼠比模型組大鼠的肺功能明顯增高。TGF-β1在血管和氣道平滑肌細胞、支氣管、細支氣管上皮細胞、肺泡上皮細胞、肺間質(zhì)細胞以及巨噬細胞均有免疫染色，細胞膜著色。對照組TGF-β1呈弱陽性表達，陽性產(chǎn)物為棕黃色顆粒，模型

8、組TGF-β1呈強陽性表達，陽性產(chǎn)物為棕褐色顆粒，二者的陽性系數(shù)和灰度值差異有統(tǒng)計學(xué)意義；干預(yù)組TGF-β1表達比模型組明顯減弱，二者的陽性系數(shù)及灰度值差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Smad4在血管和氣道平滑肌細胞、支氣管、細支氣管上皮細胞、肺泡上皮細胞、肺間質(zhì)細胞以及巨噬細胞均有免疫染色，細胞質(zhì)和細胞核均有著色。對照組Smad4呈弱陽性表達，陽性產(chǎn)物為棕黃色顆粒，模型組Smad4呈強陽性表達，陽性產(chǎn)物為棕褐色顆粒，二者的陽性系數(shù)和灰度值差異有統(tǒng)計

9、學(xué)意義；干預(yù)組比模型組Smad4表達明顯減弱，二者的陽性系數(shù)和灰度值差異有統(tǒng)計學(xué)意義。SLPI只在氣管、支氣管上皮細胞有免疫染色，且僅在細胞質(zhì)和管腔側(cè)細胞膜有著色。對照組SLPI呈強陽性表達，陽性產(chǎn)物為棕褐色顆粒，模型組SLPI呈弱陽性表達，陽性產(chǎn)物為棕黃色顆粒，二者的陽性系數(shù)和灰度值差異有統(tǒng)計學(xué)意義；干預(yù)組比模型組SLPI表達明顯增強，二者的陽性系數(shù)和灰度值差異有統(tǒng)計學(xué)意義。模型組支氣管肺泡灌洗液中SLPI濃度明顯低于對照組，差異有統(tǒng)

10、計學(xué)意義；干預(yù)組支氣管肺泡灌洗液中SLPI濃度明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。與對照組比較，模型組大鼠支氣管肺組織中TGF-β1、Smad4mRNA表達量增高，其吸光度值明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；而SLPI mRNA的表達量卻很低，其吸光度值明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。干預(yù)組大鼠支氣管肺組織中TGF-β1、Smad4mRNA表達量比模型組明顯下降，其吸光度值明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；而SLPImRNA的表達量卻明顯升高，其吸光度值

11、明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 第二部分：Smads信號通路在TGF-β1介導(dǎo)氣道上皮細胞SLPI下調(diào)中作用的研究 采用Smad4siRNA預(yù)處理及TGF-β1進行刺激支氣管上皮細胞，免疫細胞化學(xué)及westen blot方法觀Smad4、SLPI在Smad4siRNA預(yù)處理及TGF-β1進行刺激后支氣管上皮細胞內(nèi)的表達情況；RT-PCR法檢測在Smad4siRNA預(yù)處理及TGF-β1進行刺激后支氣管上皮細胞內(nèi)Smad4mR

12、NA及SLPImRNA的表達水平。 結(jié)果顯示：SLPI在胞漿胞膜均有免疫染色，在對照組中SLPI呈強陽性表達，染色為棕褐色顆粒，經(jīng)TGF-β1刺激后，SLPI在刺激組呈弱陽性表達的棕黃色顆粒；Westem blot檢測也顯示，在對照組中SLPI表達量較高，經(jīng)TGF-β1刺激后，SLPI在刺激組表達量明顯減少，二者差異差異有統(tǒng)計學(xué)意義；在對照組中SLPImRNA表達量較高，經(jīng)TGF-β1刺激后，SLPImRNA在刺激組表達量明顯降

13、低，二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Smad4在胞漿胞核均有免疫染色，在對照組中Smad4呈弱陽性表達，染色為棕黃色顆粒，經(jīng)TGF-β1刺激后，Smad4在刺激組染色呈強陽性表達的棕褐色顆粒；Westem blot檢測也顯示，在對照組中Smad4表達量較低，經(jīng)TGF-β1刺激后，Smad4在刺激組表達量明顯增高，二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義；在對照組中Smad4mRNA表達量較低，經(jīng)TGF-β1刺激后，Smad4mRNA在刺激組表達量明顯增高，二者差異有

14、統(tǒng)計學(xué)意義。經(jīng)Smad4siRNA預(yù)處理后再給予TGF-β1刺激，Smad4在干擾組的表達比單純的TGF-β1刺激組的表達明顯減弱，染色呈弱陽性表達的棕黃色顆粒；而給予陰性對照siRNMA處理后再給予TGF-β1刺激，則Smad4在HK組的表達比單純的TGF-β1刺激組的表達減弱不明顯，染色仍呈強陽性表達的棕褐色顆粒；Western blot檢測也顯示，經(jīng)Smad4siRNA預(yù)處理后再給予TGF-β1刺激，Smad4在干擾組的表達量比單

15、純的TGF-β1刺激組明顯減少，二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義。而給予陰性對照siRNA預(yù)處理后再給予TGF-β1刺激，則Smad4在HK組的表達量比單純的TGF-β1刺激組減少不明顯，二者差異無統(tǒng)計學(xué)意義。經(jīng)Smad4siRNA預(yù)處理后再給予TGF-β1刺激，Smad4mRNA在干擾組的表達量比單純的TGF-β1刺激組明顯減少，二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義；而給予陰性對照siRNA預(yù)處理后再給予TGF-β1刺激，則Smad4mRNA在HK組的表達量比單

16、純的TGF-β1刺激組的表達量減少不明顯，二者差異無統(tǒng)計學(xué)意義。經(jīng)Smad4siRNA預(yù)處理成功轉(zhuǎn)染后再給予TGF-β1刺激，SLPI在干擾組的表達比單純的TGF-β1刺激組的表達明顯增強，染色呈強陽性表達的棕褐色顆粒；而給予陰性對照siRNA預(yù)處理后再給予TGF-β1刺激，則SLPI在HK組的表達比單純的TGF-β1刺激組的表達增強不明顯，染色仍呈弱陽性表達的棕黃色顆粒；Westernblot檢測也顯示，經(jīng)Smad4siRNA預(yù)處理后

17、再給予TGF-β1刺激，SLPI在干擾組的表達量比單純的TGF-β1刺激組明顯增高，二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義；而給予陰性對照siRNA預(yù)處理后再給予FGF-β1刺激，則SLPI在HK組的表達量比單純的TGF-β1刺激組增高不明顯，二者差異無統(tǒng)計學(xué)意義。經(jīng)Smad4siRNA預(yù)處理成功轉(zhuǎn)染后再給予TGF-β1刺激，SLPImRNA在干擾組的表達量比單純的TGF-β1激組明顯增高，二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義；而給予陰性對照siRNA預(yù)處理后再給予FG