PERK-eIF2α通路負調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抵抗COPD氣道上皮細胞凋亡的機制研究.pdf

1、背景：氣道上皮細胞凋亡是COPD發(fā)病的重要機制之一，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)介導(dǎo)的細胞凋亡亦越來越被重視。在煙草等有害物質(zhì)刺激下，細胞通過啟動未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)減少蛋白合成、增加未折疊蛋白的降解以減輕細胞對應(yīng)激環(huán)境負擔(dān)。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下，PERK通路首先激活并具有極其重要的作用。PERK通過寡聚化和自身磷酸化活化，導(dǎo)致其下游因子真核翻譯起始因子2a亞單位（eIF2α）磷酸化，磷酸化的eIF2a可直接抑制蛋白合成，致使新生的多肽流出

2、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以減輕其負擔(dān)，維持細胞內(nèi)環(huán)境平衡。而當刺激持續(xù)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激將誘導(dǎo)caspase家族、CHOP等的表達誘導(dǎo)細胞凋亡。體外研究發(fā)現(xiàn)在PERK/eIF2α這條通路被敲除后，細胞對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所致凋亡敏感性增加，而增強PERK/eIF2a通路，細胞凋亡減少，證明上調(diào)PERK通路在ERS中具有對抗細胞凋亡的作用?；谀壳霸贑OPD發(fā)病中，PERK/eIF2α通路在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞凋亡中如何作用，其與CHOP、caspase關(guān)系尚不明確，擬

3、以COPD大鼠及香煙煙霧提取物(CSE)干預(yù)人支氣管上皮細胞（HBE）為主要模型，探討PERK通路相關(guān)信號分子、凋亡信號指標及之間關(guān)系，研究PERK通路的活化劑salubrinal在其中的作用，旨在證實PERK通路在COPD內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞凋亡中具有重要作用，為臨床治療COPD提供新的理論基礎(chǔ)和治療靶點。本研究分為兩個部分：
　　第一章：PERK/eIF2a通路在COPD大鼠支氣管肺組織中凋亡中的作用。
　　目的：觀察P

4、ERK通路在COPD大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所致支氣管肺組織是否活化及salubrinal對香煙煙霧所致氣道上皮細胞凋亡的影響。
　　方法：36只Wistar大鼠隨機均分為3組:正常對照組、COPD模型組、COPD模型加藥物組（簡稱干預(yù)組）。采用被動吸煙加氣管內(nèi)滴注脂多糖(LPS)法建立大鼠COPD模型，藥物組在滴注脂多糖的同時氣管內(nèi)滴注salubrinal(1 mg/kg)。造模完成后，測定各組大鼠的肺功能;觀察肺組織病理學(xué)變化;免疫組化

5、檢測p-PERK、p-eIF2α、caspase-12在支氣管肺組織中的表達和分布;western blot檢測 p-PERK、p-eIF2a、active caspase-12和active caspase-3蛋白水平;TUNEL法檢測支氣管肺組織上皮細胞凋亡。
　　結(jié)果：模型組的各項肺功能指標較正常組均明顯降低，但以salubrinal干預(yù)后大鼠各項肺功能指標較于模型組有明顯升高。在模型組中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK通路的指標p-PE

6、RK、p-eIF2a較正常組相比增高，而干預(yù)組的p-eIF2a的表達水平最高;模型組的凋亡指標active caspase-12和active caspase-3表達較正常組明顯升高，干預(yù)組凋亡較模型組減少。
　　結(jié)論：⑴采用氣管內(nèi)滴注脂多糖加煙熏的方法成功地構(gòu)建了 COPD大鼠模型;⑵COPD大鼠支氣管肺組織發(fā)生了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，啟動了PERK介導(dǎo)的UPR信號通路;⑶salubrinal可保護COPD模型大鼠支氣管肺泡上皮細胞免于凋

7、亡，可能通過調(diào)節(jié)PERK/eIF2α通路活性來實現(xiàn)其保護作用。
　　第二章：PERK/eIF2α通路在CSE誘導(dǎo)人支氣管上皮細胞凋亡的作用。
　　目的：觀察CSE對HBE細胞PERK通路相關(guān)蛋白表達的影響，并探討PERK通路在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞凋亡中的作用機制。
　　方法：第一部分，體外培養(yǎng)HBE細胞，給予5％CSE對其進行不同時間(0h-24h)的干預(yù)后，以western blot、免疫熒光等分別檢測p-PERK，

8、p-eIF2α蛋白表達;第二部分，以不同濃度的salubrinal(0-100uM)干預(yù)CSE所刺激的HBE細胞，得出其對細胞具有保護作用，且保護作用隨濃度增加而增加;再將HBE細胞分為六個處理組:對照組，5％CSE組，salubrinal組，salubrinal(1μM)+5％CSE組，salubrinal(10μM)+5％CSE組，salubrinal(100μM)+5％CSE組，以Western blot分別檢測p-PERK、p-

9、eIF2α和caspase4蛋白的表達水平，AnnexinV-PI雙標流式法測細胞凋亡。第三部分，小干擾PERK后，再以5％CSE及salubrinal干預(yù)HBE細胞，以RT-PCR檢測PERK mRNA水平，Western blot檢測p-PERK、p-eIF2a、activecaspase-3、4蛋白表達水平，AnnexinV-PI雙標流式法測細胞凋亡。
　　結(jié)果：隨著CSE濃度的增加或干預(yù)時間的延長，HBE細胞p-PERK及

10、p-eIF2a蛋白表達量逐漸增加，以5％ CSE、干預(yù)6h組增加最明顯，但繼續(xù)增加CSE濃度或延長干預(yù)時間，p-PERK及p-eIF2α表達并不增加，反而下降;salubrinal(0-100uM)干預(yù)CSE所處理的HBE細胞，得出對細胞具有保護作用，且其作用隨濃度增加而增加，其最大保護濃度為100 uM，以salubrinal干預(yù)后的細胞組其p-eIF2α蛋白表達量較其他組明顯升高;小干擾PERK后，RT-PCR、western bl

11、ot檢測小干擾組PERK表達顯著下降，PERK siRNA成功下調(diào)了PERK基因表達;PERK水平下調(diào)后，HBE細胞activecaspase-3、caspase-4的蛋白表達水平和細胞凋亡與單純的CSE刺激組比較顯著升高，但以salubrinal干預(yù)后的凋亡水平較CSE干預(yù)組低，且p-eIF2α蛋白含量增加，但p-PERK表達無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)論：⑴PERK/eIF2α通路負調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抵抗CSE誘導(dǎo)的HBE細胞凋亡，其完