Salubrinal通過調(diào)節(jié)PERK-eIF2α信號通路減弱百草枯誘導(dǎo)的人肺泡Ⅱ型上皮樣細(xì)胞A549凋亡.pdf

1、目的:通過建立百草枯中毒模型，探討Salubrina(SAL)調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)途徑中PERK-eIF2α信號通路減弱百草枯誘導(dǎo)的人肺泡Ⅱ型上皮樣細(xì)胞A549凋亡的作用機(jī)制。
　　研究方法:建立PQ誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的模型:對照組（等量PBS）、PQ250μM組、PQ500μM組、PQ750μM組、PQ1000μM組。誘導(dǎo)24h后利用MTT法測定細(xì)胞的增殖情況;應(yīng)用光學(xué)倒置顯微鏡和透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化;采用Annex

2、inⅤ-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡比例;采用分光光度法測定Caspase-3活化程度。提取細(xì)胞總蛋白，采用Western Blotting實(shí)驗方法檢測ERS通路相關(guān)蛋白GRP78，PERK，p-PERK，ATF6，c-ATF6，IRE1α和p-IRE1α，CHOP的表達(dá)變化。選擇凋亡率最高的PQ濃度500μM為干預(yù)因素，探討SAL對PQ誘導(dǎo)A549凋亡過程中ERS反應(yīng)中PERK-elF2α信號通路的影響:SAL預(yù)處理A549細(xì)胞2

3、h后再加入500μM的PQ，實(shí)驗分組:對照組（等量0.1％DMSO）、SAL30μM組、PQ500μM組、SAL1μM+PQ500μM組、SAL5μM+PQ500μM組、SAL30μM+PQ500μM組，檢測相應(yīng)的細(xì)胞增殖情況、凋亡率、Caspase-3活性變化以及PERK、p-PERK、p-eIF2α、CHOP蛋白的表達(dá)量。
　　結(jié)果:PQ誘導(dǎo)A549細(xì)胞24h后，MTT檢測相應(yīng)的細(xì)胞增殖情況，結(jié)果提示:隨PQ濃度增高，A549

4、細(xì)胞增殖明顯被抑制;光學(xué)倒置顯微鏡下可見對照組細(xì)胞大小形態(tài)規(guī)則，PQ組細(xì)胞隨著PQ濃度加大，細(xì)胞形態(tài)越發(fā)不規(guī)則，貼壁性降低，細(xì)胞連接減少;透射電鏡下觀察到PQ誘導(dǎo)后A549細(xì)胞體積縮小，核質(zhì)濃縮，染色質(zhì)逐漸聚集成新月狀附于核膜周邊，細(xì)胞膜周邊出現(xiàn)凋亡小體，粘液空泡數(shù)目較多;AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡率，發(fā)現(xiàn)A549細(xì)胞凋亡率在PQ濃度為500μM時達(dá)到最高;分光光度法測定Caspase-3活性，PQ濃度為500μ

5、M時，Caspase-3活性較對照組顯著增加;在PQ（500μM）誘導(dǎo)A549細(xì)胞3h、6h、12h、24h時，GRP78，CHOP蛋白表達(dá)量隨時間延長，蛋白表達(dá)顯著增加，p-PERK，c-ATF6和p-IRE1α的表達(dá)在6h時顯著增加。SAL以劑量依賴性方式改善了經(jīng)PQ處理后A549細(xì)胞增殖被抑制、降低凋亡率和Caspase-3活性。在SAL30μM+PQ500μM組，SAL可以誘導(dǎo)出高水平的p-eIF2α，同時CHOP表達(dá)減少，而P