可吸入溫石棉纖維通過ROS-JNK通路誘導A549細胞凋亡.pdf

1、目的：(1)觀察可吸入溫石棉纖維對A549細胞增殖抑制和凋亡作用;(2)觀察可吸入溫石棉纖維作用A549細胞過程，活性氧(reactive oxygen species，ROS)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun Nterminal kinase，JNK)對細胞凋亡的影響;(3)觀察可吸入溫石棉纖維作用A549細胞過程ROS與JNK通路之間的相互作用，進一步探索溫石棉誘導A549細胞凋亡的具體機制。
　　方法：(1)篩選可吸入溫

2、石棉纖維作用時間和濃度：以A549細胞為體外實驗研究對象,不同濃度的溫石棉(12.5、25、50、100、200μg/mL)分別作用A549細胞不同時間(12、24、48h)，同時設置陰性對照組，MTT法檢測細胞存活率;(2)觀察A549細胞形態(tài)學改變：不同濃度的溫石棉(50、100、200μg/mL)分別作用A549細胞24h，同時設置陰性對照組，使用Hoechst33258試劑染色，熒光顯微鏡下觀察并記錄;(3)探索ROS、JNK通

3、路對A549細胞凋亡的影響及兩者之間的關系：不同濃度的溫石棉(50、100、200μg/mL)分別作用A549細胞24h，并設置陰性對照組、JNK抑制組（SP600125干預）、ROS抑制組(NAC干預)，AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法分析各組的細胞凋亡率;JC-1熒光探針法檢測各組線粒體膜電位的下降程度;PI染色檢測各組細胞周期的分布變化;DCFH-DA熒光探針負載法檢測各組ROS產(chǎn)生水平;Western blot檢測p-JN

4、K蛋白、JNK蛋白、cleaved caspase-3蛋白表達變化。
　　結果：(1)可吸入溫石棉纖維可抑制A549細胞增殖，呈現(xiàn)濃度、時間效應關系：與陰性對照組比較，溫石棉作用細胞12h時，溫石綿組細胞存活率均出現(xiàn)下降(P＜0.05);溫石棉作用細胞48h時，細胞存活率顯著下降(P＜0.01)，其中以100、200μg/mL溫石棉組細胞存活率下降最為明顯;溫石棉作用A549細胞24h后，以50、100、200μg/mL溫石棉組細

5、胞存活率分別為（74.86±6.95）％、（70.04±6.52）％、（59.78±5.18）％，為方便觀察實驗結果，選擇濃度為50、100、200μg/mL的可吸入溫石棉纖維作用A549細胞24h進行后續(xù)實驗。(2)與陰性對照組相比，不同濃度溫石棉作用A549細胞后，細胞整體熒光強度增加，出現(xiàn)較多皺縮濃染的亮藍色凋亡細胞。細胞間隙增大，形態(tài)縮小、變圓，有的呈空泡狀改變，有的可見胞核濃染，甚至可見較多碎裂的凋亡小體以及馬蹄形（新月形）胞

6、核形態(tài)改變。(3)50、100、200μgfmL溫石棉組細胞凋亡率分別為（23.05±3.44）％、（31.67±1.55）％、（64.04±2.78）％，同時伴有ROS水平增高、線粒體膜電位下降、p-JNK蛋白及cleaved caspase-3蛋白的表達增加，細胞周期停滯在G2/M期。(4)抑制JNK通路后，p-JNK蛋白的表達下降(P＜0.05)，溫石棉濃度為50、100、200μg/mL的JNK抑制組凋亡率分別為（16.28±1

7、.83）％、(25.20±3.11)％、（52.82±4.57）％，線粒體膜電位的下降、cleavedcaspase-3蛋白表達的增加受抑制(P＜0.05)。(5)當溫石棉濃度為50、100μg/mL時，抑制JNK通路對細胞周期改變無明顯作用(P＞0.05);溫石棉濃度為200μg/mL時，抑制JNK通路能改善細胞的G2/M期停滯(P＜0.05)。(6)當溫石棉濃度為50、100μg/mL時，抑制JNK通路不能抑制ROS的產(chǎn)生(P＞0。

8、05);溫石棉組濃度為200μg/mL時，抑制JNK通路能減少ROS的產(chǎn)生(P＜0.05)。(7)抑制ROS產(chǎn)生后，ROS產(chǎn)生水平下降，溫石棉濃度為50、100、200μg/mL的ROS抑制組凋亡率分別為（12.26±0.97）％、（20.52±1.82）％、(47.38±2.94)％，線粒體膜電位下降受抑制，細胞G2/M期停滯有改善，p-JNK蛋白、cleaved caspase-3蛋白表達下降(P＜0.05)。
　　結論：(1