兩種蒽醌衍生物通過ROS-JNK信號通路誘導HCT116細胞死亡的研究.pdf

1、蒽醌類化合物主要存在于虎杖、大黃、蘆薈等多種中草藥中，具有抗菌、降血壓、抗氧化、抗腫瘤等多種生物活性，有的藥物已應用于臨床。天然的蒽醌類化合物存在含量低，提取困難、難分離，有心臟毒性等缺點。因此，結(jié)合抗腫瘤藥物的作用原理和機制以及蒽醌類衍生物的構效關系，合成高效低毒的衍生物是目前開發(fā)新藥的重要途徑。本課題組前期設計合成了7種具有酰胺鍵的蒽醌類衍生物，并通過MTT法檢測這7種蒽醌衍生物對8種腫瘤細胞株的增殖抑制作用，結(jié)果顯示：取代基團為甘

2、氨酸，亮氨酸，脯氨酸，纈氨酸，苯丙氨酸這5種化合物可以明顯的抑制食管癌細胞株EC9706、膽管癌細胞株QBC-939、肝癌細胞株HepG2、胃癌細胞株SGC-7901、結(jié)腸癌細胞株HCT116等腫瘤細胞的增殖，其中取代基團為亮氨酸和纈氨酸的蒽醌衍生物(分別標記為：C2和C3）對HCT116細胞增殖的抑制率最明顯。本文主要探究了C2、C3對人結(jié)腸癌HCT116細胞的作用及其機制，研究內(nèi)容如下：
　　1、為了檢測C2和C3與生物大分子

3、相互作用，通過紫外光譜、熒光光譜、圓二色譜等方法檢測了 C2和 C3與牛血清白蛋白(BSA)和小牛胸腺DNA(CT-DNA)的相互作用，實驗結(jié)果表明：兩種衍生物能與BSA相結(jié)合，使其內(nèi)源熒光發(fā)生靜態(tài)猝滅，并且破壞了BSA的α-螺旋結(jié)構；通過嵌插作用與DNA相互作用，減弱了其堿基間的相互作用。C2和C3與BSA和DNA相互作用顯著，這為進一步檢測C2和C3的抗癌活性奠定了理論基礎。
　　2、采用MTT法檢測C2和C3對人結(jié)腸癌HCT

4、116細胞增殖的抑制作用，呈劑量和時間依賴性。分別采用不同濃度的兩種衍生物作用HCT116細胞，用普通倒置顯微鏡觀察作用24 h后，細胞形態(tài)的變化，發(fā)現(xiàn)隨著衍生物濃度的增大，細胞發(fā)生顯著皺縮變圓且細胞間距增大；用DAPI染色法觀察細胞核形態(tài)的變化，可見細胞核固縮，細胞核呈現(xiàn)大小和形態(tài)不同的現(xiàn)象。通過流式細胞術檢測兩種衍生物對HCT116細胞凋亡和周期的影響，發(fā)現(xiàn)細胞周期被阻滯，出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，但是凋亡現(xiàn)象不十分明顯，猜測衍生物可能誘導細胞

5、發(fā)生自噬。通過MDC染色和GFP-LC3定位檢測，發(fā)現(xiàn)兩種衍生物能顯著誘導HCT116細胞發(fā)生自噬。兩種化合物結(jié)構相似，作用機理相同，以C3對細胞的作用為例，檢測了一定濃度C3作用細胞后，隨著作用時間的變化，凋亡相關蛋白 Cleaved PARP、Cleaved caspase9、Cleaved caspase3、p-Bcl-2、p-Bcl-xL、Bax以及Bcl-2、Bcl-xL的變化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)凋亡相關蛋白Cleaved PARP

6、、Cleaved caspase9、Cleaved caspase3、p-Bcl-2、p-Bcl-xL、Bax表達量明顯增多，而Bcl-2、Bcl-xL的表達量顯著降低，由此表明C3能顯著誘導HCT116細胞發(fā)生凋亡；并且自噬相關蛋白P62的表達量顯著降低，LC3II、 Beclin-1表達量明顯升高，可知 C3也能顯著誘導HCT116細胞發(fā)生自噬。
　　3、為了進一步檢測 C3誘導 HCT116細胞發(fā)生自噬和凋亡的機理，通過流式

7、細胞術檢測不同濃度C3作用于HCT116細胞后，ROS水平的變化。結(jié)果顯示，隨C3濃度的升高，ROS水平顯著增高；當使用ROS的特異抑制劑NAC和C3共同作用后，與單獨C3作用相比，ROS水平顯著降低。用相同濃度的C3處理HCT116細胞后，采用Western Blot技術檢測發(fā)現(xiàn)p-JNK1和p-JNK2蛋白的表達量升高且呈時間依賴性。當NAC抑制ROS后，p-JNK1和p-JNK2蛋白表達量顯著降低。因此，C3誘導HCT116細胞發(fā)

8、生自噬和凋亡，很可能是通過ROS-JNK信號通路。當用JNK磷酸化的特異性抑制劑SP500125和C3共同作用HCT116細胞后，與單獨C3作用相比，Western Blot技術分析發(fā)現(xiàn)Cleaved caspase9、Cleaved caspase3、LC3I和LC3II、Beclin-1的表達量顯著降低；經(jīng)MTT檢測后，發(fā)現(xiàn)細胞活力顯著升高。JNK1/2 siRNA干擾后其結(jié)果一致，可見C3可能是通過ROS-JNK信號通路誘導HCT