Disulfiram聯(lián)合Cu通過調(diào)節(jié)ROS-JNK,NF-κB以及Nrf2通路誘導淋巴系腫瘤細胞凋亡.pdf

1、背景:急性淋巴細胞白血病(ALL)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)是血液系統(tǒng)惡性腫瘤中較為常見的疾病,其中T-ALL由于其易對髓外組織和器官的浸潤,緩解后極易復發(fā),治療還比較困難；而Burkitt’s淋巴瘤是一種侵襲性B細胞NHL,疾病進展快,常規(guī)化療的效果不佳。隨著現(xiàn)代治療方法的改進以及支持治療的加強,大劑量多藥聯(lián)合化療提高了高危淋巴系腫瘤的完全緩解率(CR),但遠期療效并不令人滿意,復發(fā)是治療失敗的主要原因,一旦復發(fā),再次緩解率低,預后差

2、。難治復發(fā)仍然是高危淋巴系腫瘤治療的主要障礙和亟待解決的難題,而耐藥是導致難治復發(fā)的重要因素。此外,大劑量多藥聯(lián)合化療的毒副作用導致嚴重并發(fā)癥也是影響高危淋巴系腫瘤療效進一步提高的主要障礙之一,不少患者死于化療的并發(fā)癥而不是腫瘤的進展。由于化療導致的系統(tǒng)性毒性和藥物耐藥是高危淋巴系腫瘤治療失敗的主要障礙,而新的分子靶向藥物也存在價格昂貴等問題,從傳統(tǒng)價廉、且毒副作用小的藥物中開發(fā)具有抗腫瘤活性的cc新用途”越來越引起重視。
　　

3、 Disulfiram(DSF)是臨床應用超過60年的抗酗酒藥物,安全性好,價格低廉。研究發(fā)現(xiàn)DSF單藥可以誘導一系列實體瘤細胞的凋亡及抑制其增殖,但是關于其對白血病細胞的作用尚存爭議。作為二價金屬離子螯合劑,DSF能夠強烈螯合Cu離子形成DSF/Cu復合物,體外實驗發(fā)現(xiàn)Cu可顯著提高DSF誘導實體瘤細胞凋亡的作用。以往研究發(fā)現(xiàn)DSF誘導腫瘤細胞凋亡的主要機制是抑制NF-κB的表達,但關于DSF/Cu誘導實體瘤細胞凋亡的分子機制尚不明確

4、。是否還有其他機制參與DSF/Cu誘導實體瘤細胞凋亡仍需要進一步探索。
　　 藥物在誘導腫瘤細胞凋亡的同時也觸發(fā)了抗凋亡因子的產(chǎn)生,這是導致腫瘤細胞耐藥的重要機制。而NF-κB則是最主要的抗凋亡因子之一。NF-κB是包含p50和p65在內(nèi)的一種異二聚體。其中p65所占比例較多,且調(diào)控下游一系列抗凋亡基因的表達,因此,p65被認為是調(diào)控NF-κB活性的關鍵成分。抑制p65的活性可以誘導腫瘤細胞的凋亡,并且可以減少NF-κB調(diào)控的抗

5、凋亡因子的表達。而p65的過度表達可以誘導NF-κB持續(xù)活化引起細胞耐藥。
　　 ROS的產(chǎn)生是細胞呼吸作用的結(jié)果,在許多細胞生物學特性中,ROS的產(chǎn)生與一些病理過程有關。ROS可以誘導包括蛋白、磷脂以及DNA在內(nèi)的細胞結(jié)構(gòu)的破壞。研究表明腫瘤細胞ROS水平略高于正常細胞,但由于有效的抗氧化機制的存在,腫瘤細胞對相對高水平的ROS是可以耐受。但當各種因素導致腫瘤細胞的ROS水平超過其可耐受閾值則會導致腫瘤細胞的凋亡,同時高水平的

6、ROS可破壞具有抗氧化作用的轉(zhuǎn)錄因子Nrf2活性,因而進一步增強ROS介導的細胞凋亡。此外,ROS與JNK通路在誘導腫瘤細胞凋亡過程中可能存在相互促進作用。
　　 近幾十年來,Disulfiram(DSF)由于可以抑制醛脫氫酶而一直用于抗酗酒治療,副作用很小。而最近的研究則關注到DSF抗腫瘤的作用,已有不少的研究報道DSF聯(lián)合Cu可以誘導包括膠質(zhì)瘤、肺癌、黑色素瘤細胞在內(nèi)的許多實體瘤細胞的凋亡。而關于DSF/Cu對淋巴系腫瘤細胞

7、作用的研究報道較少。本課題旨在探討DSF/Cu能否有效殺傷人淋巴系腫瘤Molt4和Raji細胞株以及與ROS、JNK、Nrf2以及NF-κB通路的關系以及各通路之間的相互聯(lián)系。
　　 研究目的:本課題以人急性T淋巴細胞白血病細胞株Molt4以及B細胞淋巴瘤(Burkitt’s)細胞株Raji為研究對象,探討DSF/Cu能否在體外誘導Molt4和Raji細胞的凋亡,并進一步從ROS、JNK、Nrf2以及NF—κB通路探討其潛在的分

8、子機制。
　　 研究方法
　　 1.細胞株:人急性T淋巴細胞白血病細胞株Molt4及人B細胞淋巴瘤(Burkjtt,s)細胞株Raji。
　　 2.MTT法評價濃度分別為0.125、0.25、0.5、1、2μm/ml的DSF和上述濃度DSF聯(lián)合Cu離子(1μM)處理24小時對上述不同腫瘤細胞的體外抑制增殖的作用和明確DSF和DSF/Cu對上述腫瘤細胞的IC50。
　　 3.
　　 1)Annexi

9、n V/PI雙染色流式細胞術檢測0.125、0.25、0.5、1、2μ m/ml的DSF和上述濃度DSF聯(lián)合Cu離子(1μM)處理Molt4細胞株24小時后凋亡細胞比例；
　　 2)Annexin V/PI雙染色流式細胞術檢測0.5、1、2.5、5、7.5μ m/ml的DSF和上述濃度DSF聯(lián)合Cu離子(1μM)處理Raji細胞24小時后凋亡細胞比例；
　　 4.Hoechst33342染色法觀察不同濃度DSF和DSF/

10、Cu處理兩種腫瘤細胞后的形態(tài)變化；
　　 5.流式細胞儀檢測濃度分別為0.125、0.25、0.5、1、2μm/ml的DSF和上述濃度DSF聯(lián)合Cu離子(1μM)處理Molt4細胞株8小時候細胞內(nèi)ROS水平:
　　 6.應用實時熒光定量PCR法分別檢測濃度為0.125、0.25、0.5、1、2μm/ml的DSF和DSF聯(lián)合Cu離子(1μM)以及DSF/Cu/NAC處理Molt4細胞株24小時后Nrf2基因的表達,采用2-

11、Δct法對PCR結(jié)果進行計算,分析Nrf2的表達量與各種不同處理組的關系。
　　 7.Western Blotting檢測0.125、0.25、0.5、1、2μm/ml的DSF和上述濃度DSF聯(lián)合Cu離子(1μM)處理Molt4細胞株24小時以及Cu組(1μM)、DSF組(DSF:IC50-DSF/Cu)、DSF/Cu組(DSF:IC50-DSF/Cu,Cu:1μm)；DSF/Cu/NAC組(DSF:IC50-DSF/Cu,Cu

12、:1μm,NAC:10mM)五組作用24小時后Molt4細胞Bcl-2、JNK,磷酸化JNK(p-JNK)、Nrf2和p65蛋白表達變化。
　　 8.采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析,兩組間均數(shù)的比較使用獨立樣本t檢驗方法；配對劑量資料的比較采用配對樣本t檢驗；多組間均數(shù)比較使用單因素方差分析方法進行統(tǒng)計,在方差分析顯著的情況下使用Bonferroni(方差齊性)進行多重比較；若方差不齊則采用近似F檢驗(如Welch方法)

13、代替方差分析后采用Dunnett T3方法進行多重比較；計量資料用x±s表示,檢驗水準為α=0.05,雙側(cè)檢驗。
　　 結(jié)果
　　 1.DSF單藥及DSF/Cu對兩種細胞株在體外均有明顯抑制增殖作用。MTT結(jié)果顯示:DSF單藥對Molt4和Raji細胞24小時的IC50值分別為:(IC50-Molt4-DsF=1.314±0.229μM/ml)、(IC50-Raji-DSF=5.064±2.268μM/ml)；DSF/C

14、u對Molt4和Raji細胞的IC50值分別為:(IC50-M0lt4-DSF/Cu=0.435±0.109μM/ml),(IC50-Raji-DSF/Cu=0.891±0.093μM/ml)。DSF/Cu對Molt4和Raji細胞的IC50顯著低于DSF單藥,差異有統(tǒng)計學意義(t=-5.993、P--0.004和t=0.610、P=0.033),提示Cu可顯著增強DSF對Molt4和Raji細胞的增殖抑制作用。
　　 2.DS

15、F單藥及DSF/Cu對Molt4和Raji細胞具有誘導凋亡作用。
　　 [1]Hoechst33342染色觀察細胞凋亡的形態(tài)學改變:顯微鏡觀察不同濃度DSF和DSF/Cu對Molt4和aaji細胞處理24小時后,通過Hoechst33342染色觀察細胞凋亡的形態(tài)學改變,結(jié)果發(fā)現(xiàn),Molt4細胞株經(jīng)低濃度的DSF(0.125、0.25、0.5μM)處理后細胞凋亡特征不明顯,而當DSF濃度提高為(1、2μM)時,細胞出現(xiàn)核固縮、凝集

16、,并有凋亡小體,變現(xiàn)為明亮的顆粒狀藍染:而DSF/Cu組在低濃度組(0.125μM)就可見較典型的凋亡現(xiàn)象,但當濃度提高為0.25μM后,凋亡現(xiàn)象更加明顯,且隨DSF/Cu濃度增加而增多。Raji細胞經(jīng)DSF和DSF/Cu處理后同樣出現(xiàn)與Molt4細胞相似的形態(tài)學變化。
　　 [2]Annexin V/PI染色流式細胞術檢測凋亡細胞比例:根據(jù)MTT和預實驗結(jié)果,選取0.125、0.25、0.5、1、2μm/ml的DSF和DSF聯(lián)

17、合Cu離子(1μM)處理Molt4細胞株24小時后觀察細胞凋亡比例變化。結(jié)果顯示,DSF和DSF/Cu分別作用于Molt4濃度主效應差異存在統(tǒng)計學意義(F=423.317,P=0.000)；DSF和DSF/Cu分別作用于Molt4細胞處理方法主效應差異也存在統(tǒng)計學意義(F=84.305,P=0.000)。提示隨著DSF或者DSF/Cu濃度增加,Molt4細胞的凋亡細胞比例逐漸升高,凋亡比例表現(xiàn)劑量依賴性。進一步應用方差分析比較兩種不同處

18、理組細胞凋亡率的差異。對照組DSF、DSF/Cu的自然凋亡率分別為4.016％=1=0.930％、3.977％±0.609％。經(jīng)單因素方差分析,不同濃度的DSF或者DSF/Cu均可誘導Molt4細胞凋亡,與對照組相比均有顯著性差異(F=98.573、P=0.000:F=199.891、P=0.000)應用兩獨立樣本T檢驗發(fā)現(xiàn),同一濃度的DSF和DSF/Cu作用于Molt4細胞,其凋亡細胞比例存在統(tǒng)計學差異(t=-8.338,P=0.00

19、1；t=4.957,P=0.008；t=-24.034,P=0.001:t=-14.614,P=0.001；t=-14.52,P=0.000)。提示同一濃度的DSF/Cu比DSF更能有效誘導Molt4細胞凋亡。
　　 同樣,我們選取0.5、1、2.5、5、7.5μm/ml的DSF和DSF聯(lián)合Cu離子(1μM)處理Raji細胞24小時后觀察凋亡細胞比例；結(jié)果顯示,DSF和DSF/Cu分別作用于Raji細胞濃度主效應差異存在統(tǒng)計學意

20、義(F=356.370,P=0.000):DSF和DSF/Cu分別作用于Raji細胞處理方法主效應差異也存在統(tǒng)計學意義(F=419.434,P=0.000)。提示隨著DSF或者DSF/Cu濃度增加,Raji細胞的凋亡細胞比例逐漸升高,凋亡比例表現(xiàn)劑量依賴性。應用兩獨立樣本T檢驗檢測同一濃度下,DSF和DSF/Cu處理Raji細胞后誘導細胞凋亡比例是否存在差異。結(jié)果顯示DSF和DSF/Cu各濃度誘導細胞凋亡比例相比,均存在統(tǒng)計學差異(t=

21、-12.277,P=0.000:t=-10.748,P=0.000；t=-9.014,P=0.001:t=-8.334,P=0.001:t=-11.321,P=0.000)。根據(jù)統(tǒng)計結(jié)果,我們認為DSF和DSF/Cu對Raji細胞均存在誘導凋亡的能力,但DSF/Cu誘導細胞凋亡的作用明顯強于DSF。
　　 [3]Western blotting檢測抗凋亡蛋白表達:我們選擇不同濃度的DSF(0.125、0.25、0.5、1、2μM

22、/ml)和以上濃度DSF聯(lián)合Cu1μM作用于Molt4細胞24小時后,以Western Blotting方法檢測抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達情況。結(jié)果顯示:DSF/Cu組Molt4細胞內(nèi)Bcl-2蛋白表達較空白對照組受抑,且呈劑量依賴性。而DSF單藥組僅在很高濃度是才能下調(diào)Bel-2蛋白表達。
　　 3.DSF/Cu可提高腫瘤細胞內(nèi)的ROS水平:我們選取0、0.125、0.25、0.5、1、2μm/ml的DSF和DSF聯(lián)合Cu離

23、子(1μM)處理Molt4細胞8小時后觀察凋亡細胞內(nèi)ROS水平變化；結(jié)果顯示,DSF和DSF/Cu分別作用于Molt4細胞濃度主效應差異存在統(tǒng)計學意義(F=123.070,P=0.000)；隨著DSF或者DSF/Cu濃度增加,Molt4細胞的ROS水平比例逐漸升高,DSF/Cu組升高更加明顯,ROS水平比例表現(xiàn)劑量依賴性。應用兩獨立樣本T檢驗檢測同一濃度下,DSF和DSF/Cu處理Molt4細胞后誘導細胞內(nèi)ROS蓄積是否存在差異。結(jié)果顯

24、示DSF和DSF/Cu各濃度誘導細胞凋亡比例相比,均存在統(tǒng)計學差異(t=-8.338,P=0.001；t=-4.957,P=0.008:t=-24.034,P=0.001；t=-14.614,P=0.001:t=-14.529,P=0.000)。根據(jù)統(tǒng)計結(jié)果,我們認為DSF和DSF/Cu對Molt4細胞均存在誘導細胞內(nèi)ROS蓄積的能力,但DSF/Cu誘導誘導細胞內(nèi)ROS蓄積的能力的作用明顯強于DSF。
　　 4.DSF/Cu可下

25、調(diào)腫瘤細胞內(nèi)Nrf2的表達水平:將不同濃度的DSF和DSF/Cu分別作用于Molt4細胞24小時后,以實時熒光定量PCR方法檢測細胞內(nèi)Nrf2的表達水平。結(jié)果顯示,DSF和DSF/Cu分別作用于Molt4濃度主效應差異存在統(tǒng)計學意義(F=34.909,P=0.000)；DSF和DSF/Cu分別作用于Molt4細胞處理方法主效應差異也存在統(tǒng)計學意義(F=159.371,P=0.000)。隨著DSF/Cu濃度增加,Molt4細胞的Nrf2表

26、達水平逐漸降低,呈劑量依賴性。進一步分析比較兩種不同處理組細胞Nrf2表達水平的差異,應用兩獨立樣本T檢驗檢測同一濃度下,DSF和DSF/Cu處理Molt4細胞后Nrf2水平變化是否存在統(tǒng)計學差異。結(jié)果顯示DSF和DSF/Cu各濃度誘導細胞內(nèi)Nrf2水平變化相比較,均存在統(tǒng)計學差異0=3.263,P=0.031；t=11.668,P=0.000；t=11.563,P=0.000；t=10.612,P=0.000；t=13.142,P=0

27、.000)。結(jié)果表明DSF、DSF/Cu均可抑制細胞內(nèi)Nrt2的表達,而DSF/Cu組對Nrf2的抑制效果更加明顯。
　　 5.DSF/Cu可上調(diào)JNK通路表達,下調(diào)p65和Nrf2通路表達:將不同濃度的DSF和DSF/Cu分別作用于Molt4細胞24小時后,Western blotting結(jié)果顯示兩處理組總JNK蛋白表達均無明顯變化,DSF/Cu組磷酸化JNK(p-JNK)表達隨DSF/Cu濃度增加而明顯上調(diào),而DSF單藥組p

28、-JNK表達沒有明顯變化。同樣以Western blotting方法檢測p65蛋白變化,結(jié)果顯示DSF單藥和DSF/Cu組隨藥物濃度增高,p65表達逐漸下調(diào),但DSF/Cu組p65表達下調(diào)程度顯著高于DSF單藥組。Western blotting方法檢測Nrf2蛋白表達顯示DSF組低濃度似乎可下調(diào)Nrf2表達,但隨濃度增加這種作用反而不明顯,而DSF/Cu組隨藥物濃度增加,Nrf2表達逐漸下調(diào)。
　　 6.ROS抑制劑-NAC對

29、DSF/Cu誘導Molt4細胞凋亡的影響:應用流式細胞術觀察各濃度DSF/Cu及加入ROS抑制劑NAC后作用Molt4細胞24小時后細胞凋亡比例的變化。加入NAC后DSF/Cu誘導Molt4細胞的凋亡細胞比例均出現(xiàn)不同程度下降,應用兩獨立樣本T檢驗顯示同一濃度下DSF/Cu和DSF/Cu/NAC兩種處理后凋亡細胞比例均存在統(tǒng)計學差異(t=-1.719,P=0.161:t=5.090,P=0.007；t=-4.941,P=0.008；t=

30、4.814,P=0.009；t=4.870,P=0.008),DSF/Cu組凋亡細胞比例明顯高于DSF/Cu/NAC組。提示DSF/Cu誘導Molt4細胞的凋亡細胞比例可以被NAC所抑制。
　　 7.ROS是DSF/Cu調(diào)控JNK、p65以及Nrf2表達的關鍵:將不同濃度DSF/Cu以及DSF/Cu/NAC處理Molt4細胞24小時后,應用熒光定量PCR的方法檢測細胞內(nèi)Nrf2的表達水平。結(jié)果示加入NAC后DSF/Cu誘導Mol

31、t4細胞后Nrf2的表達水平均出現(xiàn)不同程度上升,應用兩獨立樣本T檢驗檢測同一濃度下,DSF/Cu與DSF/Cu/NAC兩種方法處理細胞24小時后觀察細胞內(nèi)Nrf2的表達水平差異。統(tǒng)計結(jié)果顯示在低濃度組(0.125μM)兩種處理的Nrf2水平無差異,但從0.25μM起,DSF/Cu和DSF/Cu/NAC處理細胞后Nrf2的水平均存在統(tǒng)計學差異,DSF/Cu組的表達水平明顯低于DSF/Cu/NAC組(t=-2.622,P=0.059；t=-

32、3.473,P=0.026；t=-4.651,P=0.010；t=-5.245,P=0.006:t=-8.693,P=0.001)。提示NAC可抑制DSF/Cu對Nrf2的表達水平的下調(diào)能力。
　　 選擇Cu(1μM)、DSF(0.5μM)、DSF/Cu(DSF:0.5μM,Cu:1μM)以及DSF/Cu/NAC(DSF:0.5μM,Cu:1μM,NAC:10mM)作用于Molt4細胞24小時后,應用Western Blotti

33、ng的方法,觀察細胞內(nèi)通路的變化。結(jié)果提示:Cu組、DSF組與空白對照組相比,p-JNK蛋白表達無明顯變化,DSF/Cu組p-JNK蛋白表達明顯增高,但可以被NAC所抑制。Cu組同空白對照組的p65表達無明顯變化,DSF組同DSF/Cu組的p65表達均較空白對照組明顯下調(diào),而DSF/Cu組p65表達下調(diào)更明顯,DSF/Cu對p65表達下調(diào)作用也可以被NAC抑制。同樣DSF/Cu組對Nrf2蛋白表達的下調(diào)作用也可被NAC所抑制。上述結(jié)果提

34、示DSF/Cu很可能通過ROS調(diào)控著JNK、p65和Nrf2的表達。
　　 結(jié)論
　　 1.DSF單藥對淋巴系腫瘤細胞具有一定的抑制增殖及誘導凋亡的作用；但Cu可顯著提高其抑制增殖和誘導凋亡的作用。
　　 2.DSF單藥及DSF/Cu均可顯著提高Molt4細胞內(nèi)ROS的水平,但DSF/Cu作用更加顯著。
　　 3.DSF/Cu能夠增加Molt4細胞內(nèi)磷酸化JNK(p—JNK)的表達水平,下調(diào)p65和Nrf