NF-κB通路負(fù)調(diào)控Keap1-Nrf2通路及其分子機(jī)制研究.pdf

1、NF-κB和Keap1-Nrf2是細(xì)胞內(nèi)兩條重要的信號(hào)通路，分別參與炎癥調(diào)節(jié)及抗氧化基因表達(dá)調(diào)控。實(shí)驗(yàn)表明許多外界刺激在抑制NF-κB活性的同時(shí)都能活化Nrf2。這提示我們這兩個(gè)發(fā)揮重要調(diào)控作用的信號(hào)通路之間可能存在著某種層次上的交互。以此為出發(fā)點(diǎn)，本研究探討了NF-κB通路和Nrf2通路之間的交互關(guān)系。
　　 首先我們建立了針對(duì)兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子活性研究的報(bào)告基因系統(tǒng)，并驗(yàn)證了其有效性。進(jìn)而研究了TNF-α、IL-1β及PMA等外源

2、刺激對(duì)NF-κB與Nrf2通路的影響，發(fā)現(xiàn)三種刺激都能活化NF-κB通路并輕微負(fù)調(diào)控Nrf2通路。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB信號(hào)通路中不同水平的激活分子在活化NF-κB的同時(shí)，能夠顯著負(fù)調(diào)控Nrf2通路，而NF-κB的負(fù)調(diào)控蛋白IκBα能夠抑制NF-κB信號(hào)通路并活化Nrf2通路。我們實(shí)驗(yàn)室前期的結(jié)果已表明活化與抑制Keap1-Nrf2通路對(duì)NF-κB通路幾無(wú)影響，這些結(jié)果提示NF-κB通路的活化可負(fù)調(diào)控Nrf2通路。TNF-α、IL-

3、1β及PMA在活化NF-κB通路時(shí)對(duì)Keap1-Nrf2通路的抑制明顯弱于NF-κB通路中激活分子的作用，可能與TNF-α、IL-1β及PMA可活化多條NF-κB外信號(hào)通路相關(guān)，表明細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路交互的復(fù)雜性。
　　 p65是NF-κB通路中最下游的蛋白質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)p65對(duì)Nrf2的負(fù)調(diào)控作用最為顯著且能夠降低Nrf2的DNA結(jié)合活性，因此推論p65可能是NF-κB通路負(fù)調(diào)控Nrf2通路的功能執(zhí)行蛋白。轉(zhuǎn)錄活性缺失的p65截短體

4、仍具有負(fù)調(diào)控Nrf2的功能，說(shuō)明這種負(fù)調(diào)控并不依賴于p65轉(zhuǎn)錄活性，可能是通過(guò)蛋白質(zhì)相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中，通過(guò)酵母雙雜交篩選發(fā)現(xiàn)p65與Nrf2的負(fù)調(diào)控蛋白Keap1存在相互作用。本論文采用免疫共沉淀、Pull Down等實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了p65與Keap1之間的相互作用，為揭示NF-κB通路負(fù)調(diào)控Keap1-Nrf2通路的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　 本論文研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)NF-κB通路的活化能夠負(fù)調(diào)控Nrf2通路，這種