丹酚酸A調控Nrf2通路對HepG2細胞氧化損傷保護機制的研究.pdf

1、目的:本研究建立HepG2細胞系的H2O2損傷模型,探討丹酚酸A(Salvianolicacid A,SAA)的細胞保護作用與二相解毒酶NQO1、GST、HO-1的誘導及轉錄因子Nrf2激活之間的關系,闡明丹酚酸A抗氧化損傷的分子機制。
　　 方法:
　　 1.丹酚酸A對HepG2細胞二相酶的誘導作用
　　 HepG2細胞隨機分成四組:正常對照組;低、中、高劑量丹酚酸A組(0.2μM、2μM、20μM)。藥物與細

2、胞共同孵育6小時后分別測定以下指標:采用化學分光光度法測定還原型谷胱甘肽(Reduced Glutathione,GSH)的含量。采用免疫印跡法(Westem blotting)檢測細胞內醌氧化還原酶(NAD(P)H:quinone oxidoreductase1,NQO1)、血紅素氧合酶-1(Heme Oxygenase-1,HO-1)、谷胱甘肽巰基轉移酶(Glutathione S-transferase,GST)的蛋白表達水平。<

3、br>　　 2.丹酚酸A對HepG2細胞Nrf2通路的激活作用
　　 (1)HepG2細胞隨機分成四組:正常對照組;低、中、高劑量丹酚酸A組(0.2μM、2μM、20μM)。藥物與細胞共同孵育6小時后測定:轉錄因子Nrf2(NF-E2-related factor2)及胞漿伴侶分子Keapl(Kelch-like ECH associated proteinl)的蛋白表達;采用半定量RT-PCR(Reverse Transcr

4、iption Polymerase Chmn Reaction)法測定HO-1、Nrf2的mRNA表達水平。
　　 (2)HepG2細胞隨機分為四組:陰性對照組(NC);轉染Nrf2 small interferingRNA(siRNA)組;陰性對照+丹酚酸A組(20μM)和轉染Nrf2 siRNA+丹酚酸A(20μM)組。轉染后,丹酚酸A作用6小時提取細胞核蛋白,免疫印跡法測定Nrf2蛋白表達水平。
　　 3.丹酚酸A

5、對H2O2損傷的HepG2細胞的保護作用研究
　　 (1)HepG2細胞隨機分為五組:正常對照組;H2O2損傷組(終濃度3.5mM);低、中、高濃度丹酚酸A組(0.2μM、2μM、20μM)。給藥2小時后,損傷組和藥物組加入H2O2,繼續(xù)培養(yǎng)4小時后進行以下試驗:采用MTT法測定細胞存活率;采用化學分光光度法測定細胞上清液中乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)含量。
　　 (2)HepG2細胞

6、隨機分為四組:正常對照組;20μM丹酚酸A組;H2O2損傷組(終濃度3.5mM);20μM丹酚酸A+H2O2組。采用免疫印跡法檢測細胞內NQO1、HO-1、GST及Nrf2的蛋白表達;采用RT-PCR法測定HO-1與Nrf2的mRNA表達水平。
　　 結果:1.丹酚酸A與HepG2細胞共同孵育6小時后,與對照組相比,藥物組GSH活性提高(P＜0.01),在中、高劑量組尤為明顯,呈劑量依賴性。
　　 2.丹酚酸A與HepG

7、2細胞共同孵育6小時后,與對照組相比,中、高濃度藥物組二相酶NQO1、HO-1、GST蛋白表達顯著升高(P＜0.01),轉錄因子Nrf2蛋白表達上調(P＜0.01),并有劑量依賴性;Keap1蛋白表達則明顯下調(P＜0.01),與二相酶及Nrf2的蛋白表達呈負相關。提示丹酚酸A對二相酶的上調是通過激活Nrf2的核易位而實現。
　　 3.Nrf2-624干擾序列轉染HepG2細胞48小時后,與對照組相比,明顯抑制Nrf2的蛋白表達

8、(P＜0.01);給予丹酚酸A后,對照組Nrf2蛋白表達水平上調(P＜0.01),而Nrf2 siRNA轉染組無明顯變化,表明促進Nrf2在正常細胞內表達是丹酚酸A的作用靶點之一。
　　 4.采用H2O2刺激HepG2細胞后,與對照組相比,損傷組細胞存活率顯著下降(P＜0.01),上清液LDH含量明顯增高(P＜0.01),中、高濃度丹酚酸A預處理組細胞存活率明顯上升(P＜0.01),低、中、高藥物預處理組LDH含量顯著增加(P＜

9、0.01),并具有濃度依賴性。顯示丹酚酸A對過氧化氫損傷的HepG2細胞具有保護作用。
　　 5.與對照組相比,H2O2刺激HepG2細胞后,20μM丹酚酸A組與損傷組NQO1、HO-1、GST和Nrf2蛋白表達明顯上升(P＜0.01),表明藥物與H2O2均可刺激Nrf2核易位。與損傷組相比,20μM丹酚酸A預處理的H2O2組蛋白表達為最高(P＜0.01),表明丹酚酸A可在細胞受損情況下進一步促進Nrf2核易位和二相解毒酶表達。